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Título: Expressão de marcadores de células germinativas e de oócitos em fibroblastos bovinos tratados com 5-aza-citidina e em células-tronco adultas cultivadas in vitro na presença de BMP-2, BMP-4 ou fluido folicular
Título em inglês: Expression of markers for germ cells and oocytes in cow dermal fibroblast treated with 5-aza-cytidine and adult stem cells in vitro cultured in presence of BMP-2, BMP-4 or follicular fluid
Autor(es): Costa, José Jackson do Nascimento
Orientador(es): Silva, José Roberto Viana
Palavras-chave: Expressão gênica
Fibroblastos bovinos
Células-tronco adultas
Cultivo in vitro
Data do documento: 2016
Citação: COSTA. J. J. N. (2016)
Resumo: Este estudo teve como objetivo investigar o efeito da 5-Aza-citidina durante a indução da pluripotência, e avaliar os efeitos do cultivo em meio contendo BMP-2, BMP-4 ou fluido folicular na diferenciação de fibroblastos em células germinativas primordias (CGP) e oócitos (fase 1). Além disso, isolar células-tronco do epitélio ovariano de bovinos e avaliar os efeitos da BMP-2, BMP-4 ou fluido folicular sobre a diferenciação destas células-tronco em estruturas semelhantes a oócitos (fase 2). Na fase 1, os fibroblastos foram tratados com 0.5, 1,0 ou 2.0 μM de 5-Aza por 18, 36 ou 72 h. Foi avaliada a morfologia, viabilidade celular e a expressão gênica (OCT-4, NANOG, REX e SOX2), para a seleção da concentração/tempo mais eficientes. Os fibroblastos foram então cultivados em meio suplementado com 10 ng/mL de BMP-2, ou 10 ng/mL de BMP-4 ou 5% de fluido folicular bovino, por 7 ou 14 dias. Posteriormente, foi feita a avaliação da morfologia e viabilidade celular, e expressão gênica (VASA, DAZL, C-KIT, SCP3, ZPA e GDF-9). Para a fase 2, as células-tronco da superfície ovariana foram isoladas, expandidas, cultivadas em meio de diferenciação contendo as 50 ng/mL de BMP-2, ou 50 ng/mL de BMP-4, ou BMP-2+BMP-4 ou 5% de fluido folicular bovino por 14 dias. Foram avaliadas as características morfológicas, viabilidade celular, e expressão da fosfatase alcalina e expressão gênica (VASA, DAZL, C-KIT, SCP3, ZPA e GDF-9). Os resultados de expressão gênica foram analisados usando ANOVA seguido pelo Teste de Kruskal Wallis (P<0,05). Na fase 1, o cultivo com 2.0 μM de 5-Aza por 72 h provocou mudanças na morfologia e na taxa de proliferação celular, e aumentou significativamente a expressão de fatores de pluripotência. Já o cultivo em meio contendo BMP-2, BMP-4 ou fluido folicular, durante 7 ou 14 dias, alterou a morfologia celular, e a expressão de genes específicos para células germinativas e oócitos. Na fase 2, as células-tronco do ovário expressaram genes de pluripotência e após o cultivo, as células apresentaram características morfológicas que se assemelhavam a CGP e a células semelhantes a oócitos, incluindo a expressão da fosfatase alcalina e a expressão de genes específicos de células germinativas e oócitos. Em conclusão, o presente estudo descreve a possibilidade de converter os fibroblastos da pele de bovinos e células-tronco da superfície ovariana, em células semelhantes a oócitos, através do processo de reprogramação celular, associado à suplementação do meio com BMP-2, BMP-4 e fluido folicular.
Abstract: This study aimed to investigate the effect of 5-Aza-cytidine during induction of pluripotency, and evaluate the effects of culture in medium containing BMP-2, BMP-4 or follicular fluid in the differentiation of fibroblasts in primordias germ cells (CGP) and oocytes (stage 1). Furthermore, isolation of stem cells from the bovine ovarian epithelium and evaluate the effects of BMP-2, BMP-4 or follicular fluid on the differentiation of these stem cells into structures similar to oocytes (stage 2). In phase 1, fibroblasts were treated with 0.5, 1.0 or 2.0 μM of 5-Aza for 18, 36 or 72 h. Morphology cell viability and gene expression (OCT-4, NANOG, SOX2 and REX), were assessed, for the selection of the concentration/time more efficient. The fibroblasts were then cultured in medium supplemented with 10 ng/mL BMP-2 or 10 ng/mL BMP-4 or 5% bovine follicular fluid by 7 or 14 days. Subsequently, evaluation of the morphology and cell viability was taken, and gene expression (VASA, DAZL, c-Kit, SCP3, ZPA and GDF-9). For phase 2, the stem cells of ovarian surface were isolated, expanded, grown in differentiation medium containing 50 ng/mL BMP-2 or 50 ng/mL BMP-4, or BMP-2+BMP-4 or 5% bovine follicular fluid for 14 days. Morphological characteristics, cell viability and expression of alkaline phosphatase and gene expression (VASA, DAZL, C-KIT, SCP3, ZPA and GDF-9), were evaluated. The gene expression results were analyzed using ANOVA followed by Kruskal-Wallis test (P <0.05). In stage 1, the culture with 2.0 μM of 5-Aza for 72 h caused changes in morphology and cell proliferation rate, and significantly increased the expression of pluripotency factors. The culture in medium containing BMP-2, BMP-4 or follicular fluid for 7 or 14 days, altered cellular morphology, and expression of specific genes for stem cells and oocytes. In stage 2, the ovarian stem cells expressed pluripotent genes, and after culture, this cells showed morphologic characteristics similar to PGC and oocytes, including the expression of alkaline phosphatase, and the expression of specific genes for PCG and oocytes. In conclusion, the present study describes the possibility of conversion of the skin fibroblasts and stem cells from ovarian surface of the bovine, in oocyte-like cells, similar oocyte cells, through the cell reprogramming process associated with the supplementation of BMP-2, BMP- 4 and follicular fluid.
Descrição: COSTA, José Jackson do Nascimento. Expressão de marcadores de células germinativas e de oócitos em fibroblastos bovinos tratados com 5-aza-citidina e em células-tronco adultas cultivadas in vitro na presença de BMP-2, BMP-4 ou fluido folicular. 2016. 207 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/19321
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