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Title in Portuguese: Avaliação do efeito citotóxico da frutalina (lectina de Artocarpus incisa L.) no cultivo in vitro de folículos pré-antrais caprinos.
Title: Evaluation of the cytotoxic effect of frutalin (lectin of Artocarpus incisa L.) on in vitro culture of preantral goat follicles.
Author: Costa, Maria Amélia Araújo Soares
Advisor(s): Silva, José Roberto Viana
Keywords: Frutalina
Cultivo celular
Folículo ovariano caprino
Toxicidade
Issue Date: 2017
Citation: COSTA, M. A. A. S. (2017)
Abstract in Portuguese: O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da frutalina (lectina de Artocarpus incisa L.) sobre a ativação, sobrevivência, ultraestrutura e expressão gênica dos folículos pré-antrais caprinos cultivados in situ e sobre o cultivo in vitro de folículos secundários caprinos isolados. Para a fase I, fragmentos ovarianos caprinos foram cultivados durante 6 dias em α-MEM+ sozinho ou suplementado com frutalina (1, 10, 50, 100 ou 200 μg/mL). Os fragmentos ovarianos não-cultivados (controle fresco) e cultivados foram destinados a análise histológica, ultraestrutural e de expressão dos genes anti- e pró-apoptóticos por qPCR. Para a fase II, folículos secundários foram microdissecados e cultivados por 6 dias em meio α-MEM+ sozinho ou suplementado com doxorrubicina (0,3 μg/mL) ou frutalina (0,6, 6 ou 60 μg/mL). Apos o cultivo, folículos secundários foram analisados quanto à sobrevivência, crescimento, formação de antro e expressão dos genes anti- e pró-apoptóticos por qPCR. Na fase I, a frutalina em todas as concentrações testadas não influenciou na ativação de folículos primordiais, mas reduziu a sobrevivência folicular. As concentrações mais elevadas da frutalina (50, 100 ou 200 μg/mL) reduziram a sobrevivência folicular, quando comparadas com os tecidos cultivados com 1 ou 10 μg/mL de frutalina. A análise ultra-estrutural mostrou que após o cultivo os folículos atrésicos apresentavam oócitos retraídas e um grande número de vacúolos distribuídos por todo o citoplasma. Também, verificou-se que apesar de um efeito dose-resposta não ter sido observado na expressão gênica, quando comparado com tecido cultivado no meio controle, a presença da frutalina aumentou a expressão do RNAm de genes pró-apoptóticos. Na fase II, a doxorrubicina e a frutalina (0,6, 6 e 60 μg / mL) reduziram significativamente a percentagem de folículos normais quando comparado com o meio α-MEM+. A doxorrubicina reduziu a viabilidade folicular quando comparado com a frutalina em todas as concentrações testadas. Além disso, a porcentagem de folículos normais após o cultivo com frutalina (0,6 e 6,0 μg/mL) foi maior do que na presença de 60,0 μg/mL (p <0,05). Com exceção dos folículos cultivados com 0,6 μg/mL de frutalina, a taxa de crescimento folicular foi reduzida após o cultivo na presença de doxorrubicina ou frutalina, quando comparada com o meio controle (p <0,05). Cerca de 60% dos folículos cultivados em α-MEM + apresentaram formação de antro, mas a presença de doxorrubicina ou frutalina reduziu a formação de antro (P<0,05). A presença de doxorrubicina ou de frutalina (60,0 μg/mL) aumentou o nível de RNAm para CASP3, CASP6, BAX e BCL2 (P<0,05), mas os maiores níveis de transcritos para CASP3, CASP6, BAX foram encontrados em folículos cultivados com doxorrubicina, quando comparados com aqueles cultivados em frutalina (60,0 μg/mL). Por outro lado, os folículos cultivados com frutalina apresentaram níveis mais altos de RNAm para BCL2 (P <0,05), quando comparados com aqueles cultivados na presença de doxorrubicina. Em conclusão, a frutalina não influencia na ativação dos folículos primordiais in vitro, e mantém uma elevada percentagem de folículos saudáveis (> 60%) quando usada em baixas concentrações (1 e 10 μg/mL). Também, as características ultraestruturas dos folículos cultivados mostram que a necrose é a principal via de morte celular. Além disso, a frutalina tem efeitos tóxicos mais baixos do que a doxorrubicina em folículos secundários caprinos cultivados in vitro.
Abstract: The objective of this work was to evaluate the effect of frutalin (lectin of Artocarpus incisa L.) on the activation, survival, ultrastructure and gene expression of preantral follicles grown in situ and on in vitro culture of isolated goat secondary follicles. For phase I, goat ovarian fragments were cultured for 6 days in α-MEM+ alone or supplemented with frutalin (1, 10, 50, 100 or 200 μg/mL). The uncultured (fresh control) and cultured ovarian fragments were intended for histological, ultrastructural analysis and expression of anti-and pro-apoptotic genes by qPCR. For phase II, secondary follicles were microdissected and cultured for 6 days in α-MEM + medium alone or supplemented with doxorubicin (0.3 μg/mL) or frutalin (0.6, 6 or 60 μg/mL). After culturing, secondary follicles were analyzed for survival, growth, antrum formation and expression of anti-and pro-apoptotic genes by qPCR. In phase I, frutalin at all concentrations tested did not influence the activation of primordial follicles, but reduced follicular survival. Higher concentrations of frutalin (50, 100 or 200 μg/mL) reduced follicular survival when compared to tissues cultured with 1 or 10 μg/mL frutalin. Ultrastructural analysis showed that after cultivation the atretic follicles had retracted oocytes and a large number of vacuoles distributed throughout the cytoplasm. Also, it was found that although a dose-response effect was not observed in the gene expression, when compared to tissue cultured in the control medium, the presence of frutalin increased the mRNA expression of pro-apoptotic genes. In phase II, doxorubicin and frutalin (0.6, 6 and 60 μg / mL) significantly reduced the percentage of normal follicles when compared to α-MEM + medium. Doxorubicin reduced follicular viability when compared to frutalin at all concentrations tested. In addition, the percentage of normal follicles after frutalin (0.6 and 6.0 μg / mL) was higher than in the presence of 60.0 μg / mL (p <0.05). With the exception of follicles cultivated with 0.6 μg / mL frutalin, the follicular growth rate was reduced after cultivation in the presence of doxorubicin or frutalin when compared to the control medium (p <0.05). Approximately 60.0% of follicles cultured in α-MEM+ presented antrum formation, but the presence of doxorubicin or frutalin reduced the formation of antrum (P <0.05). The presence of doxorubicin or frutalin (60.0 μg / mL) increased the mRNA level for CASP3, CASP6, BAX and BCL2 (P <0.05), but the highest levels of transcripts for CASP3, CASP6, BAX were found in follicles cultured with doxorubicin when compared to those grown in frutalin (60.0 μg / mL). On the other hand, follicles cultivated with frutalin had higher levels of mRNA for BCL2 (P <0.05) when compared to those cultured in the presence of doxorubicin. In conclusion, frutalin does not influence the activation of the primordial follicles in vitro, and maintains a high percentage of healthy follicles (> 60%) when used in low concentrations (1 and 10 μg / mL). Also, the ultrastructural characteristics of cultured follicles show that necrosis is the main pathway of cell death. In addition, frutalin has lower toxic effects than doxorubicin in in vitro cultured goat secondary follicles.
Description: COSTA, Maria Amélia Araújo Soares. Avaliação do efeito citotóxico da frutalina (lectina de Artocarpus incisa L.) no cultivo in vitro de folículos pré-antrais caprinos. 2017. 141 s. Tese (Doutorado em Biotecnologia)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/29896
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