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dc.contributor.advisorPessoa, Cláudia do Ó-
dc.contributor.authorSoares, Bruno Marques-
dc.date.accessioned2018-07-04T11:40:44Z-
dc.date.available2018-07-04T11:40:44Z-
dc.date.issued2018-02-21-
dc.identifier.citationSOARES, B. M. Estudo da interação com DNA, citoxicidade e da atividade das topoisomerases I e II do derivado de bufadienolídeo 3-Acetato de bufalina. 2018. 138 f. Tese (Doutorado em Farmacologia)- Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2018.pt_BR
dc.identifier.urihttp://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/33374-
dc.description.abstractBufadienolides show a wide variety of biological activities, including antineoplastic activities. The present study evaluated the cytotoxic potential and mechanisms of action of two bufadienolides: bufalin (BUF-05) and 3-acetate bufalin (BUF-06). Cytotoxic potential was evaluated using seven human tumor cell lines, three normal murine cell lines and human peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Both bufadienolides were shown to be quite cytotoxic to all tumor cell lines (IC50 from 3 to 32 nM), with BUF06 being slightly more potent than BUF05. In PBMCs, bufadienolides showed IC50 values of about 25nM. The compounds showed no cytotoxicity towards normal murine. The PC-3 prostate cell line was chosen to elucidate the mechanism of action of the bufadienolides. Impedance based real-time growth assay analysis showed that both bufadienolides have a similar profile, increasing impedance in the first few hours, then reducing below the control curves, and finally reaching plateau shortly thereafter. Light scanning photomicrographs showed an increase in cell size for both bufadienolides. Cell viability by flow cytometry indicated a reduction in the number of cells and mebrane integrity at 24 and 48 hours. Morphological analysis by flow cytometry revealed that both compounds increased the number of apoptotic cells. Moreover, morphological analysis using differential staining showed the emergence of apoptotic and necrotic cells. In order to confirm the apoptotic profile, phosphatidylserine externalization detection was performed, which showed an increase of initial apoptosis after 24 hours and late apoptosis after 48 hours incubation for both bufadienolides. The compounds also showed mitochondrial depolarization for both incubation times. Western blot analysis revealed a discrete cleavage of PARP and caspase 8. However, effector caspases 3 and 7 were not activated. Low expression of antiapoptotic components Bcl-2 and Bcl-xL, as well as decrease of proapoptotic Bax suggest non-induction of apoptotic cell death. Evaluation of nuclear DNA content showed that both bufadienolides provoked cell arrest in the G2/M phase after 24 and 48 hours incubation. When analyzing cyclin expression involved in the cell cycle, the absence of cyclin A2 and accumulation of cyclin B1 was observed for both compounds, possibly indicating arrest in M phase. DNA damage was accessed by comet assay and phosphorylated H2AX labeling, which showed that the compounds were not able to produce DNA damage. Evaluation of the involvement of DNA repair pathways using DT40 knockout cells suggested that PARP may be involved in the cell death caused by both bufadienolides tested. PARP hyperactivation is a hallmark of parthanatos, a regulated type of necrotic cell death. Furthermore, topoisomerase-mediated DNA cleavage assays showed the inhibition of topoisomerase II by both BUF-06 and BUF-05. In silico molecular docking assays revealed strong affinity of both bufadienolides for the ATPase portion of topoisomerase IIα, indicating possible catalytic inhibition. Overall, these results indicate that 3-acetate bufalin has a cytotoxic profile similar to bufalin.pt_BR
dc.language.isopt_BRpt_BR
dc.subjectNeoplasias da Próstatapt_BR
dc.subjectApoptosept_BR
dc.subjectNecrosept_BR
dc.subjectDNA Topoisomerases Tipo IIpt_BR
dc.titleEstudo da interação com DNA, citoxicidade e da atividade das topoisomerases I e II do derivado de bufadienolídeo 3-Acetato de bufalinapt_BR
dc.typeTesept_BR
dc.description.abstract-ptbrOs bufadienolídeos possuem uma grande variedade de atividades biológicas, incluindo atividade antineoplásica. O presente estudo avaliou o potencial citotóxico bem como o mecanismo de ação de dois bufadienolídeos: a bufalina (BUF-05) e seu análogo 3-acetato de bufalina (BUF-06). O potencial citotóxico foi avaliado em sete linhagens tumorais humanas, três linhagens murinas normais e em células mononucleadas do sangue periférico (CMSP) humano. Ambos os bufadienolídeos se mostraram bastante citotóxicos (IC50 3 a 32 nM), onde 3-acetato de bufalina se mostrou mais potente que bufalina. Em relação a CMSP, os bufadienolídeos também se mostraram citotóxicos (IC50 25 nM). Os bufadienolídeos não se mostraram citotóxicos para as linhagens murinas. A linhagem celular de próstata PC-3 foi escolhida para determinação dos mecanismos de ação dos bufadienolídeos. A análise do crescimento celular em tempo real por impedância mostrou que tanto BUF-06 como BUF-05 possuem perfil similar com aumento da impedância logo nas primeiras horas, reduzindo após 24 horas para abaixo da curva do controle negativo e atingindo platô em seguida. A viabilidade das células por citometria de fluxo indicou a redução do número de células e integridade de membrana em 24 e 48 horas. A análise morfológica por citometria de fluxo revelou aumento do número de células em padrão apoptótico. Já a análise morfológica por coloração diferencial, mostrou o surgimento de células tanto com padrão apoptótico quanto necrótico. No intuito de confirmar o perfil apoptótico, foi realizado a determinação da externalização de fosfatidilserina, a qual mostrou aumento significativo de apoptose inicial em 24 horas e apoptose tardia para 48 horas em ambos os bufadienolídeos. Os bufadienolídeos apresentaram, ainda, despolarização mitocondrial em ambos os tempos de incubação. As análises por western blot revelaram que houve clivagem discreta de PARP e caspase 8. No entanto, as caspases efetoras 3 e 7 não se mostraram ativadas. A diminuição da expressão dos componentes antiapoptóticos Bcl-2 e Bcl-xL, bem como dimuição do componente pró-apoptótico Bax sugere a não indução de morte por apoptose. A avaliação da quantidade de DNA nuclear revelou que ambos os bufadienolídeos causaram acúmulo de células na fase G2/M após 24 e 48 horas de incubação. Ao se analisar a expressão de ciclinas envolvidas no ciclo celular, foi observada ausência da ciclina A2 e acúmulo de B1 para ambos os compostos, podendo indicar acúmulo de células na fase M. As avaliações por meio do ensaio do cometa e marcação de H2AX fosforilado, os quais revelaram que os compostos não foram capazes de causar dano ao DNA. A avaliação do envolvimento das vias de reparo de DNA utilizando células DT40 knockout, mostrou que PARP pode estar envolvido no processo de morte promovido pelos bufadienolídeos. Além disso, os ensaios de clivagem de DNA mediados por topoisomerase mostraram a inibição de topoisomerase II tanto por BUF-06 como por BUF-05. Ensaios in silico por docking molecular revelaram forte afinidade para a porção ATPásica de topoisomerase IIα, indicando uma possível inibição catalítica. Desse modo, os resultados apontam que 3-acetato de bufalina possui perfil citotóxico semelhante a bufalina.pt_BR
dc.title.enStudy of the iteraction with DNA, cytoticity and the activity of topoisomerases I and II of the bufadienolide derivative 3-Acetate bufalinpt_BR
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