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Título: Transformação genética de feijão-caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp] e tabaco (Nicotiana tabacum) com uma quitinase de classe I
Título em inglês: Genetic transformation of cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp] and tobacco (Nicotiana tabacum) with a class I chitinase
Autor(es): Jereissati, Emmanuel de Sousa
Orientador(es): Carvalho, Cristina Paiva da Silveira
Palavras-chave: Biologia Molecular
quitina
Melhoramento genético
Feijão-caupi
Quitinase
Data do documento: 2012
Citação: JEREISSATI, E. S.; CARVALHO, C. P. S. (2012)
Resumo: A expressão heteróloga de genes que codificam proteínas relacionadas à patogênse (PR-proteínas) representa uma alternativa promissora para o desenvolvimento de plantas resistentes ao ataque de fungos. Dentre as PR-proteínas com grande potencial biotecnológico, estão as quitinases, hidrolases que catalisam a degradação da quitina, que é um polímero constituinte da parede celular de muitas espécies de fungos fitopatogênicos. Além da função relacionada aos mecanismos de defesa, acredita-se que essas enzimas podem desempenhar outros papéis, como a regulação de processos de crescimento e desenvolvimento em plantas. O objetivo deste trabalho foi estudar o papel de uma quitinase de classe I de feijão-caupi (VuChiI) na defesa e no desenvolvimento vegetal e para isso duas abordagens foram conduzidas. A primeira consistiu no silenciamento do gene que codifica esta proteína em plantas de feijão-caupi. Nos experimentos de silenciamento gênico foram utilizados meristemas apicais de plântulas de feijão-caupi, que foram então bombardeados com micropartículas portando um vetor de silenciamento (pKANNIBAL), onde foi clonada uma construção em grampo (intron harpin) do gene de VuChiI. As plantas regeneradas em meio de cultura de Murashige e Skoog (MS) contendo o herbicida imazapyr, como agente de seleção, foram analisadas por PCR, o que resultou na confirmação da transformação genética de cinco plantas, a partir de 1.092 meristemas apicais bombardeados. O RNA foi extraído das plantas transformadas e utilizado em análises de Northern blot que possibilitou a detecção de siRNAs no RNA total extraído das plantas putativamente transgênicas. Apenas uma das plantas transformadas produziu uma vagem contendo seis sementes, das quais apenas uma germinou. As plantas transformadas apresentaram ciclo de vida de mais de 365 dias enquanto que o esperado é de 65-70 dias. Com base nos resultados sugere-se que o silenciamento da quitinase de classe I de feijão-caupi pode ter promovido alteração no desenvolvimento da planta. A segunda estratégia de transformação genética consistiu no co-cultivo de discos foliares de tabaco com suspensão de Agrobacterium tumefaciens LB4404, com o intuito de expressar a proteína recombinante no espaço extracelular das plantas regeneradas. Essa estratégia tem como objetivo fazer com que a proteína entre em contato com o fungo antes mesmo que este agente patogênico penetre na célula vegetal. Para tanto, o inserto referente à quitinase de feijão-caupi foi clonado no vetor binário pCAMBIA1305.2 sob controle do promotor CaMV35S e fundido ao peptídeo sinal GRP (glycine-rich protein de Oryza sativa), que permite a secreção da proteína recombinante via apoplasto. Foram produzidas três linhagens de plantas que tiveram a transformação genética confirmada por PCR. As sementes obtidas das plantas transformadas, geração R1, foram semeadas em meio seletivo para a análise da transmissão do transgene. O teste de X2 indicou que o transgene foi transmitido para a progênie em proporções Mendelianas. Os modelos experimentais desenvolvidos neste trabalho poderão contribuir para a elucidação dos papéis biológicos da quitinase de classe I de feijão-caupi.
Abstract: Heterologous expression of genes encoding pathogenesis related proteins (PR-proteins) represents a promising alternative for the development of plants resistant to fungi. Among the PR-proteins with great biotechnological potentials are the chitinases, a class of hydrolases which catalyze the degradation of chitin, a polymer constituent of cell wall of several species of pathogenic fungi. Besides their function related to defense mechanisms, it is believed that these enzymes may play other roles, such as regulation of growth and development processes in plants. Using two approaches, this study sought to investigate the role of a class I chitinase of cowpea (VuChiI) in defense and plant development. The first approach consisted of silencing of the gene encoding for VuChiI in cowpea. Apical meristems excised from cowpea seeds were bombarded with microparticles containing a silencing vector (pKANNIBAL), which was cloned with a construct harboring an intron harpin of the gene VuChiI. Plants regenerated in a Murashige and Skoog (MS) media containing imazapyr as a selection agent, were analyzed by PCR, resulting in confirmation of genetic transformation of five plants from the 1092 apical meristems bombarded. Northern blot analysis of total RNA extracted from the putative transgenic plants allowed for the detection of siRNAs. Upon regeneration and germination, only one of the five transformed plants produced a pod containing six seeds. Of these, only one germinated when further planted. The transformed plants exhibited a life cycle of over 365 days, as against the normal cycle of 65-70 days. Based on these results we posit that silencing of class I cowpea chitinase may have led to changes in plant development. The second strategy consisted of co-cultivation of tobacco leaf discs with Agrobacterium tumefaciens strain LB4404 suspension to express recombinant protein in the extracellular space of the regenerated plants in order to expose the protein fungus even before its penetration into the plant cell. To achieve this, a sequence of cowpea chitinase insert was cloned into the binary vector pCAMBIA1305.2 under the control of CaMV35S promoter and signal peptide fused to glycine-rich protein of Oryza sativa (GRP), which allowed the secretion of recombinant protein via apoplast. This led to the generation of three strains as confirmed by PCR. Seeds obtained from transformed R1 generation of the plants were germinated and analyzed for transmission of the transgene using X2 test, which confirmed its transmission to the progeny in a Mendelian fashion. The experimental models developed in this work may serve to further assess the biological roles of class I chitinase from cowpea.
Descrição: JEREISSATI, E. S. Transformação genética de feijão-caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp] e tabaco (Nicotiana tabacum) com uma quitinase de classe I. 2012, Transformação genética de feijão-caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp] e tabaco (Nicotiana tabacum) com uma quitinase de classe I. 120 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/10479
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