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Title in Portuguese: Mediação dos receptores TLR2, NOD1, e da proteína MYD88 na modulação da mucosite intestinal induzida pelo irinotecano
Title: Measurement of TLR2 receptor, NOD1 and MyD88 protein in the modulation of intestinal mucositis induced by irinotecan
Author: Wong, Deysi Viviana Tenazoa
Advisor(s): Ribeiro, Ronaldo de Albuquerque
Keywords: Camptotecina
Mucosite
Receptores Toll-Like
Proteína Adaptadora de Sinalização NOD1
Issue Date: 2013
Citation: WONG, D. V. T. Mediação dos receptores TLR2, NOD1, e da proteína MYD88 na modulação da mucosite intestinal induzida pelo irinotecano. 2013. 198 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2013.
Abstract in Portuguese: O câncer colorretal (CCR) é uma das neoplasias mais prevalentes em todo o mundo, sendo uma das principais causas de óbito por câncer. Dentre as drogas utilizadas como primeira linha no tratamento do CCR e do CCR metastático hepático, o irinotecano apresenta destaque pelo impacto sobre o aumento da sobrevida dos pacientes. Contudo, o surgimento de efeitos colaterais associados ao irinotecano (IRI), como a mucosite intestinal (MI), tem impactado negativamente no curso terapêutico do paciente, observando-se atrasos nos ciclos subsequentes de quimioterapia, redução de doses e, por vezes, interrupção do tratamento. A MI e a diarréia grave são efeitos colaterais frequentes que pode atingir de 15-25% dos pacientes em quimioterapia. Objetivos: Estudar os parâmetros funcionais da barreira intestinal e os mecanismos envolvidos na mucosite intestinal induzida pelo Irinotecano e seu metabólito ativo, SN-38. Métodos: Camundongos C57BL/6 machos (WT), 20-25g, foram divididos em grupos (n=6-8), administrados por 4 dias com salina (5 mL/Kg, i.p) ou com irinotecano (IRI, 75 mg/Kg, i.p). Os animais foram analisados no 5º dia [D5] ou 7º dia [D7] quanto ao peso corpóreo, escores de diarreia, contagem de leucócitos. Após sacrifício, uma amostra de intestino foi coletada para dosagem de mieloperoxidase, análise histopatológica, morfométrica, e imunohistoquímica para TLR4. Adicionalmente, realizou-se o teste de permeabilidade e perfusão intestinal in vivo. Avaliou-se também a bacteremia e a translocação bacteriana em linfonodo mesentérico e fígado. Em adição, a participação de receptores Toll-like 2 (TLR2), 4 (TLR4) e 9 (TLR9) da proteína adaptadora MyD88 e NOD1 na mucosite intestinal foi verificada pelo uso de camundongos knockout com deleção gênica específica para aqueles receptores e seus respectivos camundongos selvagens (WT). Adicionalmente, realizou-se a avaliação dos efeitos in vivo e in vitro do SN-38. Os dados foram analisados com ANOVA/teste de Bonferroni ou Kruskal Wallis/teste de Dunn. P<0,05 foi aceito. (Protocolo CEPA 99/10). Resultados: A injeção de IRI causou uma significativa (P<0,05) perda ponderal, leucopenia e diarreia, associada a um aumento da infiltração de neutrófilos no jejuno, íleo e pulmão, com alterações morfométricas e uma intensa destruição da arquitetura dos vilos e criptas, apoptose celular em camundongos WT versus animais injetados com salina. Além disso, o IRI induz uma alteração da barreira intestinal evidenciada pela diminuição da excreção de lactulose, aliado a um aumento significativo (P<0,05) da secreção intestinal de sódio, potássio e cloreto. Os camundongos injetados com Irinotecano apresentaram bacteremia e translocação bacteriana (P<0,05) no linfonodo mesentérico e fígado, quando comparados ao grupo salina. A identificação bioquímica das bactérias translocadas evidenciou a presença de Escherichia coli (75%), Citrobacter sp. (17,2%), Bactérias Gram-Negativas Não-Fermentadoras e Pseudomona aeruginosa (18%) no grupo injetado com Irinotecano, aliado a um significativo aumento (P<0,05) da imunomarcação para TLR4 no intestino de animais injetados com IRI D5 (4[3-4]) e D7 (4[3-4]) versus o grupo salina (1,5[1-4]). Observamos que a deleção gênica para o receptor TLR2 e a proteína adaptadora MyD88, mas não para TLR4 ou TLR9, preveniram a perda ponderal e o dano funcional, relacionado aos eventos de diarreia, bem como as alterações morfométricas, histopatológicas, infiltração de neutrófilos e bacteremia induzida pelo Irinotecano versus o grupo WT injetado com IRI (P<0,05). Entretanto, a deficiência genética de NOD1 conferiu uma reduzida diarreia, sem reverter o dano pró-inflamatório induzido pelo IRI. Adicionalmente, o SN-38 causou um aumento da atividade de mieloperoxidase (P<0,05), sem alterar a secreção intestinal na alça isolada de camundongos (P>0.05) versus o grupo injetado com salina. O SN38 foi capaz de induzir alterações morfológicas nas células intestinais de ratos (IEC-6). Conclusão: O IRI induziu alteração dos parâmetros funcionais, detectadas pelo teste de permeabilidade e de perfusão intestinal. O IRI induziu uma bacteremia e translocação bacteriana para órgãos periféricos. Além disso, a deficiência do receptor Toll-like do tipo 2, e da proteína MyD88 previniu o dano intestinal e a diarreia induzida pelo IRI. Contudo, a deficiência de receptores NOD1 somente melhorou a diarreia. Adicionalmente, o SN38 foi associado a um aumento da infiltração de neutrófilo, sem alteração da secreção intestinal no modelo de alça isolada.
Abstract: The Colorectal Cancer (CRC) is one of the most prevalent neoplastic diseases in the world and is one leading cause of death. Irinotecan is a drug used as first line treatment for CRC and its liver metastases and has markedly improved the overall survival of patients. However, irinotecan-related side-effects, which include intestinal mucositis (IM), have impacted negatively on therapeutic outcome, leading to delayed chemotherapy cycles, dose reductions and treatment interruption. IM and life-threatening diarrhea may affect up to 15-25% of patients under irinotecan-based cancer chemotherapy regimens. Aims: To study the intestinal barrier function and the mechanisms involved in the IM induced by irinotecan and its active metabolite, SN-38. Methods: Male C57BL/6 mice (WT, n=6-8) were divided into groups and injected with saline (5 mL/kg, i.p.) or irinotecan (IRI, 75 mg/kg, i.p.) for 4 days. Body weight, diarrhea and blood leukocyte count were assessed on days 5 [D5] and 7 [D7]. Following euthanasia, intestinal samples were collected for histopathology, morphometry, mieloperoxidase and imunohistochemistry assays. In addition, in vivo intestinal permeability and perfusion tests were performed. Bacteremia and bacterial translocation to mesenteric lymph node and liver were further carried out. Additionally, the participation of toll-like receptors 2 (TLR2), 4 (TLR4) and 9 (TLR9), the adaptor protein MyD88 and NOD1 receptor in the pathogenesis of IM were investigated by the use of WT mice and knockout with target gene disruptions. Furthermore, the in vivo and in vitro effects of SN-38 were studied. Data analysis was performed with ANOVA/Bonferroni’s test or Kruskal Wallis/Dunn’s test. P<0,05 was accepted. (CEPA 99/10). Results. IRI-injected WT mice presented a marked (P<0.05) weight loss, leukopenia, diarrhea, increased neutrophil infiltration in lung, jejunum, ileum associated with villi and crypt morphologic alteration and apoptotic cell death versus saline-administered mice. Besides, reduced lactulose renal excretion, gut secretion of sodium, potassium and chloride evidenced intestinal barrier dysfunction in IRI-injected WT mice versus saline-administered control mice (P<0.05). Bacterermia and bacterial translocation to mesenteric lymph node and liver were also observed in the IRI group. Biochemical identification of translocating bacteria revealed the presence of Escherichia coli (75%), Citrobacter sp. (17.2%), non-fermenting gram-negative bactéria and Pseudomona aeruginosa (18%) in blood samples of IRI-injected mice. In addition, an increased TLR4 imunoexpression was detected in that group (IRI D5: 4[3-4] and D7: 4[3-4]) when compared with saline control (1.5[1-4]). Gene deletion to TLR2 and MyD88, but not to TLR4 or TLR9, prevented weight loss, diarrhea, intestinal morphometric alterations, neutrophil infiltration in the gut and bacteremia development versus the IRI-injeted WT group (P<0.05). However, NOD1 deletion was protective only against IRI-induced diarrhea without affecting the inflammatory infiltration. Furthermore, SN-38 promoted a marked neutrophil infiltration in ileum loops (P<0.05) but did not induce intestinal secretion of liquids (P>0.05) versus saline injected mice. Besides, cultured intestinal cells (IEC-6) incubated with SN-38 presented morphological changes in comparison to DMEN-cultured cells. Conclusions: IRI induced functional alterations in the gut and also bacteremia and bacterial translocation to peripheral organs. TLR2 and MyD88 deficiency prevented IRI-related intestinal damage and the diarrhea. However, NOD1 deficiency was protective only against diarrhea development. In addition, SN-38 might be responsible for the intestinal inflammatory reaction without affecting gut secretion of liquids.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/10654
metadata.dc.type: Tese
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