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Title in Portuguese: Estratégias de estocagem de sporothrix spp. e análise da sensibilidade das cepas ante aos derivados terpênicos farnesol e terpinen-4-ol in vitro
Title: Porotrichosis is a subcutaneous mycosis that affects humans and animals caused by the dimorphic fungi of the genus Sporothrix
Author: Silva, Natalya Fechine
Advisor(s): Brilhante, Raimunda Sâmia Nogueira
Co-advisor(s): Sidrim, José Júlio Costa
Keywords: Testes de Sensibilidade Microbiana
Sporothrix
Micoses
Issue Date: 2014
Citation: SILVA, Natalya Fechine. Estratégias de estocagem de sporothrix spp. e análise da sensibilidade das cepas ante aos derivados terpênicos farnesol e terpinen-4-ol in vitro. 2014. 62 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Médica) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014.
Abstract in Portuguese: A esporotricose é uma micose subcutânea que acomete humanos e animais, causada pelos fungos dimórficos do gênero Sporothrix. A estocagem de tais micro-organismos em coleções de culturas se faz necessária para o monitoramento das cepas de Sporothrix spp. ao longo dos anos. Apesar da existência de terapias antifúngicas eficazes contra esta doença, a busca por novas drogas para o tratamento se faz necessária. Compostos como farnesol e terpinen-4-ol foram testados frente a leveduras e fungos filamentosos e têm demonstrado um amplo espectro antifúngico. Desta maneira, o presente trabalho teve por objetivo buscar novas estratégias de preservação do patrimônio biológico e genético de espécies do gênero Sporothrix, avaliar a atividade inibitória in vitro de farnesol e terpinen-4-ol frente a cepas de Sporothrix spp., bem como avaliar os mecanismos de ação desses compostos. Em relação à estocagem foram utilizadas 20 cepas de Sporothrix spp. nas seguintes condições: em solução salina (NaCl a 0,9%) à 4 °C, glicerol 10% acrescido de lactose 10% e glicerol 10% acrescido de sacarose 10% mantidas nas temperaturas de -20 °C e -80 °C, estocadas nos intervalos de tempo de 3, 6 e 9 meses. A viabilidade das cepas foi avaliada através dos aspectos macro e micromorfológicos. Para tanto, as amostras foram repicadas em ágar batata e, após sete dias de incubação a 28 °C foram avaliados quanto à textura e pigmentação das cepas. Para a análise micromorfológica foi feita a contagem de conídios, tendo como referência os seguintes intervalos de 0-10, 10-50, 50-100 e >150 conídios. Para a análise da atividade inibitória dos compostos foram utilizadas 40 cepas de Sporothrix spp. na fase filamentosa. O estudo foi desenvolvido utilizando ensaio de microdiluição em caldo, descrito no documento M38-A2, padronizado pelo CLSI. Para a investigação do mecanismo de ação das drogas em relação à permeabilidade da membrana celular, foram utilizadas 16 cepas de Sporothrix spp. e realizadas leituras em espectrofotômetro nos comprimentos de onda de λ = 260 nm, com intuito de verificar a quantidade de ácido nucleico e λ = 280 nm, com intuito de verificar a quantidade de proteína liberada no meio. As cepas de Sporothrix spp. apresentaram viabilidade de 100% para o crescimento em ágar batata em todas as condições de estoque testadas, enquanto que em relação à contagem de conídios os métodos de estoque que apresentaram melhor resultado foram a solução salina a 4°C, glicerol acrescido de lactose e glicerol acrescido de sacarose mantidos a -20°C. Os derivados terpênicos farnesol e terpinen-4-ol inibiram todos os isolados de Sporothrix spp. testados com valores de CIM variando de 0,015 a 1,0 μM para o farnesol (média geométrica de 0,09) e de 0,57 a 9,27 mM para terpinen-4-ol (média geométrica de 2,35). Os valores CFM variaram entre de 0,125 a 4,0 μM e de 1,15 a 37,1 mM para farnesol e terpinen-4-ol, respectivamente. Farnesol foi o composto mais ativo para as todas as cepas de Sporothrix. Não houve perda significativa de material intracelular após tratamento das células fúngicas com concentrações de CIM e CIM/2 dos terpenos testados quando comparados com as correspondentes amostras não tratadas. Dessa forma, foi possível observar que os terpenos não apresentaram capacidade de lise frente às células de Sporothrix, o que sugere que seu principal mecanismo de ação não está relacionado com danos irreversíveis na estrutura da membrana celular. Assim, novos estudos são necessários para melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na atividade antifúngica dos terpenos avaliados.
Abstract: Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis that affects humans and animals caused by the dimorphic fungi of the genus Sporothrix. The storage of such microorganisms in culture collections is necessary to monitor the strains of Sporothrix spp. over the years. Despite the existence of effective antifungal therapies against this disease the search for new drugs for the treatment is necessary. Compounds such as farnesol and terpinen-4-ol have been tested against yeasts and filamentous fungi and have shown a broad antifungal spectrum. Thus, the present study aimed to seek new strategies for the preservation of biological and genetic patrimony of the genus Sporothrix, evaluate the in vitro inhibitory activity of farnesol and terpinen-4-ol against strains of Sporothrix spp., as well as evaluating the mechanisms of action of these compounds. Regarding the storage, 20 Sporothrix spp. strains were used and stocked under the following conditions: saline (0.9% NaCl) at 4 °C, 10% glycerol plus 10% lactose and 10% glycerol plus 10% sucrose maintained at -20 °C and -80 °C, stocked in intervals of 3, 6 and 9 months. The viability of the strains was evaluated by the macro and micromorphological aspects. For this purpose, the samples were subcultured in potato agar for seven days at 28 °C and evaluated for texture and pigmentation of the strains. For the micromorphological analysis, conidia count was performed using the ranges of 0-10, 10-50, 50-100 and >150 conidia as reference ranges. 40 Sporothrix spp. strains in the filamentous phase were used for the analysis of the inhibitory activity of the terpenes. The study was conducted using broth microdilution assay, described in M38-A2 document, standardized by CLSI. 16 Sporothrix spp. strains were used for the investigation of the mechanism of action of the terpenes in relation to the cell membrane permeability and readings were performed in a spectrophotometer at a wavelength of λ=260 nm, in order to verify the amount of nucleic acid and at λ=280 nm, in order to verify the amount of protein released into the medium. Sporothrix spp. strains showed 100% viability for growth on potato agar in all stock conditions tested, while in relation to the conidia count the stock methods that showed better results were saline at 4 °C, glycerol plus lactose and glycerol plus sucrose kept at -20 °C. The terpenes farnesol and terpinen-4-ol inhibited all Sporothrix spp. isolates tested with MIC values ranging from 0.015 to 1.0 mM for farnesol (geometric mean of 0.09) and 0.57 to 9.27 mM for terpinen-4-ol (geometric mean of 2.35). CFM values ranged between 0.125 to 4.0 mM and 1.15 to 37.1 mM for farnesol and terpinen-4-ol, respectively. Farnesol was the most active compound for all Sporothrix strains. There was no significant loss of intracellular material after treatment of fungal cells with concentrations of MIC and MIC/2 of terpenes tested when compared to the corresponding untreated samples. Therefore, it was observed that the terpenes showed no ability to lyse the Sporothrix cells, suggesting that its main mechanism of action is not associated with irreversible damage to the cell membrane structure. Thus, further studies are needed to better understand the mechanisms involved in the antifungal activity of the terpenes evaluated.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/11703
metadata.dc.type: Dissertação
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