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Title in Portuguese: “Análise da viabilidade e expressão de genes de virulência de Streptococcus mutans em lesões dentinárias de crianças com cárie precoce da infância”
Title: Analysis of viability and virulence gene expression of Streptococcus mutans in dentinal lesions from children with early childhood caries
Author: Bezerra, Daniela da Silva
Advisor(s): Rodrigues, Lidiany Karla Azevedo
Co-advisor(s): Stipp, Rafael Nóbrega
Keywords: Cárie Dentária
Dentina
RNA Mensageiro
Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real
Issue Date: 2014
Citation: BEZERRA, D. S. “Análise da viabilidade e expressão de genes de virulência de Streptococcus mutans em lesões dentinárias de crianças com cárie precoce da infância”. 2014. 74 f. Tese (Doutorado em Odontologia) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014.
Abstract in Portuguese: A cárie precoce da infância (CPI) é caracterizada pela presença de uma ou mais lesões em superfície dentária de crianças menores de 6 anos de idade, sendo considerada um problema de saúde pública. Streptococcus mutans (SM) é considerado o principal agente etiológico da doença e possui vários atributos de virulência que permitem sua sobrevivência na cavidade oral e, portanto, sua seleção em situações de estresse nesse ambiente. Neste contexto, este trabalho teve por objetivos: (a) padronizar um método de extração e purificação de RNA total para viabilizar estudos de expressão gênica bacteriana de lesões de cárie dentinária in vivo (capítulo 1); (b) identificar e quantificar SM metabolicamente ativo e analisar a expressão dos genes de virulência atpD, fabM, nox, pdhA e aguD em lesões dentinárias ativas e inativas (capítulo 2). Foi realizada a coleta de 29 amostras de dentina cariada ativa e de 16 amostras de lesões dentinárias inativas de crianças com CPI. As amostras foram submetidas à extração e purificação do RNA total por um método padronizado, com base no uso de lise mecânica e kit de extração comercial e, em seguida, submetidas às reações de transcrição reversa (RT) para obtenção do DNA complementar (cDNA). Com o intuito de comprovação da especificidade dos primers para os genes de virulência de SM em amostras in vivo, 06 amostras de cDNA foram amplificadas e submetidas ao sequenciamento de Sanger para cada primer. Após verificação da especificidade, reações em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real da transcrição reversa (RT-qPCR) foram executadas para todas as amostras. Os resultados obtidos mostraram que o RNA bacteriano pôde ser extraído em adequada quantidade e qualidade pelo protocolo padronizado, viabilizando seu uso em estudos de expressão de genes bacterianos em dentina cariada (Capítulo 01). Os resultados da RT-qPCR mostraram que, apesar da baixa quantificação em relação aos estreptococos e bactérias totais, SM viáveis foram detectados com quantificação semelhante em lesões ativas e inativas (p>0.05). Apesar disso, maior expressão dos genes de virulência pdhA e aguD foi detectada nas lesões inativas (p≤0,05) (Capítulo 02). Concluiu-se que, após padronização de uma técnica eficaz de extração de RNA, reações de RT-qPCR foram executadas com eficiência para identificação, quantificação e expressão gênica de SM em amostras de dentina humana cariada. SM estavam viáveis nos dois grupos de lesões, porém só nas lesões dentinárias inativas mostraram maior expressão dos genes pdhA e aguD, provavelmente para viabilizar sua atividade metabólica nas condições menos favoráveis à sua sobrevivência, inerentes a este substrato.
Abstract: Early childhood caries (ECC) is characterized by the presence of one or more lesions on dental surface of children under 6 years old, being considered a public health issue. Streptococcus mutans (SM) is considered the main etiologic agent of the disease and has several virulence features that allow its survival in the oral cavity and, therefore, its selection under environmental stress situations. In this context, this research had as objectives; (a) to describe a method of total RNA extraction and purification to conduct studies on bacterial gene expression from in vivo dentine caries lesions (Chapter 01); (b) to identify and quantify the metabolically active SM and analyze the expression of its virulence genes atpD, fabM, nox, pdhA and aguD on active and arrested dentin lesions (Chapter 02). Twenty-nine samples of active dentin caries and 16 samples of arrested dentin lesions were collected from children with ECC. The samples were submitted to extraction and purification of total RNA through a customized method, based on the use of a mechanical lysis and a commercial extraction kit and submitted to reverse transcriptase (RT) reaction to obtain complementary DNA (cDNA). Next, to demonstrate the primers specificity for the virulence genes on in vivo samples, 06 cDNA samples were submitted to Sanger’s sequencing for each primer. After verifying the specificity, RT-qPCR (quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction) were executed for all the samples. The results showed that the bacterial RNA could be extracted in appropriate quantity and quality through the customized protocol, making its use on gene expression studies on dentin affected by caries (Chapter 01). The RT-qPCR results showed that, despite the low quantification, if compared to total streptococci and total bacteria, SM was detected as metabolically active with similar quantification on active and arrested lesions (p>0.05). Despite that, a higher expression of the virulence genes pdhA and aguD was detected on arrested lesions (p≤0,05) (Chapter 02). It was concluded that after standardization of an effective RNA extraction technique, reactions of RT-qPCR were efficiently executed for SM identification, quantification, and gene expression on samples of human dentin affected by caries. This bacterium proved to be viable, however, only inactive lesions showed larger expression of the genes pdhA and aguD, probably to make its metabolic activity viable, even in unfavorable survival conditions.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/12438
metadata.dc.type: Tese
Appears in Collections:DCOD - Teses defendidas na UFC

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