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Title in Portuguese: Estudos dos fungos dimórficos Coccidioides posadasii e Histoplasma capsulatum var. capsulatum : caracterização laboratorial com ênfase no perfil de sensibilidade ao sesquiterpeno farnesol, in vitro
Title: Study of dimorphic fungi Coccidioides posadasii and Histoplasma capsulatum var. capsulatum : laboratory characterization with emphasis in the susceptibility to sesquiterpene farnesol, in vitro
Author: Lima, Rita Amanda Chaves de
Advisor(s): Brilhante, Raimunda Sâmia Nogueira
Keywords: Coccidioides
Histoplasma
Biofilmes
Issue Date: 2013
Citation: LIMA, R. A. C. de. Estudos dos fungos dimórficos Coccidioides posadasii e Histoplasma capsulatum var. capsulatum : caracterização laboratorial com ênfase no perfil de sensibilidade ao sesquiterpeno farnesol, in vitro. 2013. 115 f. Tese (Doutorado em Microbiologia Médica) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013.
Abstract in Portuguese: Os fungos dimórficos Coccidioides spp. e Histoplasma capsulatum var. capsulatum, são os agentes causadores da coccidioidomicose e da histoplasmose, respectivamente, sendo capazes de acometer o homem e outros animais. A genética das populações H. capsulatum var. capsulatum têm sido caracterizadas mundialmente. Contudo, para Coccidioides spp. ainda há escassez de estudos de variabilidade genética, especialmente em isolados do Brasil. De modo geral, a terapia antifúngica contra essas micoses é efetiva, embora em quadros crônicos ou disseminados, o tratamento seja muitas vezes, prolongado e difícil de tolerar. Ademais, casos refratários e recidivos já foram descritos. Recentemente, foi demonstrada a capacidade de H. capsulatum de formar biofilme. Pouco se sabe sobre qual o papel desse mecanismo na patogênese da histoplasmose e nenhum relato sobre a sensibilidade à antifúngicos de H. capsulatum em biofilme, foi descrito até o momento. Na busca por novos compostos com atividade antifúngica, o sesquiterpeno farnesol tem se destacado por seu efeito inibitório sobre o crescimento de bactérias e fungos. Diante do exposto, este trabalho teve por objetivo realizar a caracterização molecular de isolados brasileiros de C. posadasii, bem como, determinar o efeito in vitro do farnesol ante aos fungos dimórficos C. posadasii e H. capsulatum var. capsulatum, avaliando sua atuação sobre o crescimento fúngico, sensibilidade aos antifúngicos, permeabilidade celular, produção de ergosterol e sobre o crescimento em biofilme. Para tanto, cepas de C. posadasii foram avaliadas por meio das técnicas de RAPD e M13-fingerprinting. O método de macrodiluição foi utilizado para determinar a concentração inibitória mínima (CIM) de farnesol isolado em combinações com antifúngicos. C. posadasii também foi submetido quantificação do ergosterol após a exposição concentrações sub-inibitórias de farnesol. Ademais, a atividade do farnesol ante C. posadasii também foi avaliada na presença de estresse osmótico, induzido por adição de NaCl ao meio de cultura, durante os ensaios de sensibilidade. Por fim, cepas de H. capsulatum foram avaliadas na fase filamentosa e na fase leveduriforme, pelo método de microdiluição com farnesol isolado e em combinação com antifúngicos. A sensibilidade antifúngica destas drogas também foi avaliada ante H. capsulatum sob a forma de biofilme. Os resultados de RAPD e M13-fingerprinting mostraram perfis eletroforéticos semelhantes, mostrando poucos polimorfismos entres os isolados. O farnesol exibiu valores de CIMs baixos, variando de 0,0078-0,0616 µM para C. posadasii e de 0,0078-0,0312 para H. capsulatum. As combinações de farnesol com antifúngicos mostraram efeitos sinérgicos (FICI ≤ 0,5) em ambas as espécies. A quantificação de ergosterol, mostrou que a exposição a concentrações sub-inibitórias de farnesol diminuiu a quantidade de ergosterol extraído das células fúngicas e CIM’s mais baixos foram encontrados para o farnesol quando as cepas foram submetidas a estresse osmótico, indicando que esse composto atua na membrana fúngica. As combinações de farnesol com itraconazol e com anfotericina B apresentaram as maiores porcentagens de redução do crescimento fúngico em biofilme. Em conclusão, o farnesol apresentou resultados promissores como agente antifúngico ante C. posadasii e H. capsulatum, apresentando também ação adjuvante aumentando a sensibilidade aos antifúngicos in vitro. Ademais, este estudo contribuiu para caracterização do perfil de sensibilidade do biofilme de H. capsulatum in vitro, bem como para caracterização genética dos isolados de C. posadasii do Brasil.
Abstract: Dimorphic fungi Coccidioides spp. and Histoplasma capsulatum var. capsulatum are the causative agents of coccidioidomycosis and histoplasmosis, respectively, being able to affect humans and other animals. The population genetics of H. capsulatum var. capsulatum ha ve been characterized worldwide. However, there are few studies of g enetic variability for Coccidioides spp., especially in isolates from Brazil. In general, antifungal therapy is effective against these mycoses, although in chronic or disseminated cases , the treatment is often prolonged and difficult to tolerate. Moreover , recurrence and refractory cases have been reported. Recently, it was demonstrated that H. capsulatum is able t o form biofilm. Little is known about the role of this mechanism in the pathogenesis of histoplasmosis and no report on the antifungal susceptib ility of H. capsulatum in biofilm was described to date. In search for new compounds with antifungal activity, the sesquiterpene farnesol has gained prominence for their inhibitory effect on the growth of bacteria and fungi. Considering the above, this stu dy aimed to perform molecular characterization of Brazilian isolates of C. posadasii , as well as, to determine the in vitro effect of farnesol against dimorphic fungi C. posadasii and H . capsulatum var . capsulatum , assessing its effect on fungal growth, sensitivity to antifungal agents, cell permeability, production of ergosterol and in biofilm growth. Thus, strains of C. posadasii were evaluat ed using the techniques of RAPD, M13 - fingerprinting . M acrodilution method was used to determine the min imum inhibitory concentration ( MIC) of farnesol alone and in combination with antifungals . C. posadasii was also subjected to quantification of ergosterol after exposure to sub - inhibitory concentrations of farnesol. In addition , farnesol activity against C. posadasii was also evaluated in the presence of osmotic stress induced by the addition of NaCl to the culture medium during the susceptibility test. Finally, H. capsulatum strains were evaluated in filamentous and yeast phase by microdilution method with farnesol alone and in combination with antifungals. The antifungal susceptibility of these drugs was also evaluated against H. capsulatum in a biofilm. The results of RAPD and M13 - fingerprinting showed similar electrophoretic profiles, showing few polymorphism s among the isolates . F arnesol exhibited low MIC values , ranging from 0.0078 to 0.0616 μ M for C. posadasii and 0.0078 to 0.0312 μM for H. capsulatum . Combinati ons of farnesol with antifungal showed synergistic effects (FIC I ≤ 0.5) in both species Quantification of ergosterol showed that exposure to sub - inhibitory concentrations of farnesol decreased the amount of ergosterol extracted from fungal cells and MIC's lower been found to farnesol when the strains were subjected to osmotic stress, indicating that this compound acts on the membrane fungal . Combinations of farnesol with itraconazole and amphotericin B showed the highest reduction percentages of fungal growth in biofilm . In conclusion, farnesol drug showed promising r esults as antifungal agent against C. posadasii and H. capsulatum , presenting adjuvant action and increasing sensitivity to antifungal agents in vitro . Furthermore, this study contributes to the characterization of the sensitivity profile of the biofilm of H. capsulatum in vitro as well as for genetic characterization of isolates of C. posadasii from Brazil
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/13757
metadata.dc.type: Tese
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