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Title in Portuguese: Cromatografia de permeação em gel em escala semi-preservativa aplicada à caracterização, purificação e fracionamento do ácido hialurônico produzido por cultivo de microorganismos
Title: Gel permeation chromatography in semi-preparative scale apply to the characterization, purification and fractionation of microbial hyaluronic acid
Author: Sousa, Anayla dos Santos
Advisor(s): Azevedo, Diana Cristina Silva de
Keywords: Engenharia química
Ácido hialurônico
Cromatografia
Purificação
Issue Date: 20-Mar-2007
Citation: SOUSA, A. S. Cromatografia de permeação em gel em escala semi-preservativa aplicada à caracterização, purificação e fracionamento do ácido hialurônico produzido por cultivo de microorganismos. 94 f. 2007. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química)–Centro de Tecnologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2007.
Abstract in Portuguese: O Ácido Hialurônico (AH) é um polímero linear, não ramificado, composto por unidades dissacarídicas simples, cuja massa molar pode se distribuir num largo intervalo (104-107 Da). É usado em aplicações farmacêuticas e cosméticas dependendo de sua massa molar média. A separação de macromoléculas da ordem de grandeza do AH é possível através da Cromatografia de permeação em gel (GPC). Este trabalho tem como objetivo estudar a caracterização, purificação e fracionamento do AH produzido por microorganismos, utilizando GPC. O AH, cedido pelo Departamento de Processos Biotecnológicos (DPB/FEQ/UNICAMP), foi obtido por cultivo de microorganismos - Streptococcus zooepidemicus - em meio de cultura sintético. Após centrifugação do caldo de fermentação, o AH foi precipitado com etanol e ressuspenso em solução salina, sendo esta etapa de pré-purificação executada até quatro vezes. A presença de contaminantes protéicos foi identificada por eletroforese em gel de poliacrilamida sob condições desnaturantes (SDS-PAGE) e quantificada pelo método de Bradford, obtendo-se 97,20 μg/mL, para a amostra de AH após quatro precipitações em etanol e ressuspensões em NaNO3 0,1 M. Para as determinações de concentração de AH nas amostras estudadas, utilizou-se o sal sódico de AH microbial comercial (Sigma Aldrich - EUA) como padrão. Quantificando-se a amostra de AH após quatro precipitações em etanol e ressuspensões em NaNO3 0,1 M, obteve-se 783,70 μg/mL. A distribuição da massa molar do AH foi avaliada por GPC, em escala analítica, utilizando coluna Shodex OHPak-SB806M-HQ e, em escala semi-preparativa, a coluna Superose 6, detectores de índice de refração e UV/Vis (280 nm), NaNO3 0,1 M como fase móvel, vazão de 0,8 mL/min e padrões de Dextrana e Pullulan (polímeros de volume hidrodinâmico semelhante ao AH) como marcadores de massa molar (5,2x103 - 7,9x106 Da e 5,8x103 – 8,53x105 Da, respectivamente). A amostra apresentou uma distribuição polimérica na faixa de 103 a 107 Da, após quatro precipitações em etanol e ressuspensões em NaNO3 0,1 M, sendo sua massa molar média da ordem de 105 Da. Foi possível separar frações de AH, acima de 105 Da, livre de contaminantes protéicos, num intervalo de aproximadamente 10 minutos, na coluna Superose 6
Abstract: Hyaluronic acid (HA) is a linear, unbranched polymer, composed by simple disaccharide units, whose molar mass may range in a wide interval of distribution (104-107 Da). It is used in pharmaceutical and cosmetic applications depending on its average molecular mass. The fractionation of macromolecules of the order of magnitude of the HA may be performed by gel permeation or size-exclusion chromatography (GPC). The objective of this work is to study the characterization, purification and fractionation of microbial HA by using GPC. HA was supplied by the Department of Biotechnological Processes (DPB/FEQ/UNICAMP), having been produced by microorganisms – Streptococcus zooepidemicus – in synthetic culture media. After being centrifuged from the fermentation broth, HA was precipitated with ethanol and then dissolved in saline solution, this pre-purification procedure being performed up to four times. The presence of proteic contaminants was identified by electrophoresis in polyacrylamide gel under denaturant conditions (SDS-PAGE) and quantified by the Bradford method. For the HA sample which had been precipitated in ethanol and dissolved in 0.1 M NaNO3 four times, protein concentration was found to be nearly 100 μg/mL. The sodium salt of commercial (Sigma Aldrich - EUA) microbial HA was used as standard in order to measure a calibration curve to assess HA concentration in the samples. For the sample precipitated in ethanol and dissolved in 0.1 M NaNO3 four times, AH concentration was found to be approximately 780 μg/mL. Molar mass distribution of HA samples was assessed by GPC, both in analytical and semi-preparative scale, using refractive index (RI) and UV/Vis (280 nm) detectors, 0.1 M NaNO3 as mobile phase, flow rate 0.8 mL/min and tracers dextran and pullulan (polymers of similar hydrodynamic volume as compared to HA) as molar mass standards. The samples showed molar mass distributions in the range of 103 to 107 Da, after being precipitated and dissolved four times. For these samples, the average molar mass was found to be in the order of magnitude of 105 Da. In the semi-preparative column Superose, it was possible to separate HA fractions, with molar mass above 105 Da, and free of proteic contaminants, in an elution interval of 10 minutes
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/15772
metadata.dc.type: Dissertação
Appears in Collections:DEQ - Dissertações defendidas na UFC

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