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Título: Imobilização de uma β-galactosidase produzida por Kluyveromyces lactis NRRL Y-1564 cultivada em soro de leite.
Autor(es): Lima, Ariosvana Fernandes
Orientador(es): Gonçalves, Luciana Rocha Barros
Palavras-chave: Caracterização enzimática
Galactosidase
β
Kluyveromyces
imobilização enzimática.
enzyme characterization
enzyme imobilization.
Lactose
Enzimas imobilizadas
Leveduras
Data do documento: 2012
Citação: LIMA, A. F. (2012)
Resumo: A hidrólise enzimática da lactose por β-galactosidase desempenha importante papel no processamento de produtos lácteos, sendo uma das aplicações à obtenção de leite com lactose reduzida para o consumo por indivíduos com intolerância à lactose, produção de cápsulas de enzimas para tratamento e a prevenção da cristalização em produtos lácteos. Neste contexto, este trabalho foi desenvolvido visando a seleção de cepas de Kluyveromyces produtoras da enzima β-galactosidase usando um resíduo agroindustrial, o soro de leite como meio de cultivo. Inicialmente, realizou-se a seleção de espécies de Kluyveromyces capazes de produzir β- galactosidase utilizando lactose como fonte de carbono, em meio complexo e posteriormente em soro de leite (50 g/L de lactose) desproteinado e suplementado com extrato de levedura (1 g/L). Após definir a levedura que apresentava maior produção da enzima de interesse, estudou-se a produção e a viabilidade de imobilizá-la em quitosana. Após, caracterizou-se a enzima solúvel e imobilizada, consistindo na determinação do pH e temperatura ótimos, estabilidade térmica, estimativa dos parâmetros termodinâmicos e determinação dos parâmetros cinéticos Km e Vmáx usando como substrato ONPG. As cepas de K. marxianus LAMI CE025 e CCA 510 não consumiram lactose em meio complexo. As demais cepas foram avaliadas quanto à produção de β-galactosidase em soro de leite. A atividade máxima de 3,7 U/mL foi obtida por K. lactis NRRL Y-1564 após 12 h de cultivo a 180 rpm e 30ºC, sendo selecionada como micro-organismo para a produção da β-galactosidase. O pH ótimo para a enzima solúvel e imobilizada foram 6,5 e 7,0, respectivamente, e temperatura ótima de 50 e 37°C para a β-galactosidase solúvel e imobilizada, respectivamente. A enzima solúvel e imobilizada mostrou perfis semelhantes de desactivação a 40 ° C. Durante mais de 200 min, ambos os biocatalisadores mostrou a mesma estabilidade, retendo cerca de 50% da sua actividade inicial. Entretanto, a 50ºC, a enzima imobilizada mostrou uma maior estabilidade térmica, sendo 8 vezes mais estável. Os parâmetros cinéticos Km e Vmáx foram 3,34 mM e 1,78 mM/min para a β-galactosidase solúvel comparado com 3,68 mM e 3,38 mM.min para a enzima imobilizada. Na hidrólise de lactose utilizando a enzima solúvel a 37ºC e pH 7,0 foi verificada uma conversão de 30,77% da lactose para a carga de 2,0 U e 9,8% usando 0,5 U. Após o 10º reciclo de uso, a enzima imobilizada reteve 74% da atividade inicial. A β-galactosidase imobilizada, estocada em tampão fosfato de potássio pH 7,0 a 4°C manteve 100% de sua atividade enzimática inicial no período de 93 dias. A β-galactosidase solúvel perdeu 9,4% de sua atividade inicial quando foi estocada nas mesmas condições. De acordo com os resultados obtidos, o soro de leite mostrou-se uma fonte de carbono alternativa para produção de β-galactosidase de K. lactis NRRL Y1564 e a quitosana ativada com glutaraldeído é um suporte alternativo adequado de baixo custo para imobilização da β-galactosidase, proporcionando a enzima imobilizada estabilidades térmicas, operacional e de armazenamento comparado com a enzima solúvel.
Abstract: The enzymatic hydrolysis of lactose by β-galactosidase plays an important role in the processing of dairy products, such as the production of milk containing low concentrations of lactose, the prevention of crystallization in dairy products, and the use of galactosyltransferase for synthesizing galacto-oligosaccharides. In this context, this work aims to study how Kluyveromyces strains can be used to produce β-galactosidase from an agro-industrial by-product such as whey. The species studied were K. marxianus (LAMI CE 025, CCA 510, ATCC 36907) and K. lactis(NRRL Y-1564 and Y-4087). This work also aims to investigate the immobilization of the enzyme onto chitosan and determine its properties such as the optimal operating pH and temperature, the thermal stability of the enzyme, the thermal desnaturation constant, the half-life and the kinetic parameters Km and Vmax using ONPG as substrate of the enzyme β-galactosidase from Kluyveromyces lactis strain NRRL Y1564. K. marxianus LAMI CE 025 and CCA 510 did not consume lactose of the complex medium. The other strains were studied for β-galactosidase production in whey. The maximum enzymatic activity of 3.7 U/mL was achieved by K. lactis NRRL Y-1564 after 12h of fermentation at 180 rpm and 30°C, being selected as a microorganism for β-galactosidase production. The optimal pH for soluble β-gal activity was found to be 6.5 while the optimal pH for immobilized β-gal activity was found to be 7.0, while the optimal operating temperatures were 50°C and 37°C, respectively. The soluble and immobilized enzyme showed similar deactivation profiles at 40°C. For more than 200 min, both biocatalysts showed the same stability, retaining approximately 50 % of their initial activities. However, However, the immobilized enzyme showed an increased stability (8 times) at 50°C. In the lactose hydrolysis at 37°C and pH 7.0 by soluble enzyme was observed a conversion of 58.68% using a enzymatic charge of 2.0 U and 17.57% to 0.5 U. The immobilized enzyme was reused for 10 cycles, showing a good operational stability by retaining more than 74% of its initial activity. The immobilized enzyme retained 100% of its initial activity when it was stored at 4°C and pH 7.0 for a period of 93 days. The soluble β-galactosidase lost 9.4% of its initial activity when it was stored at the same conditions. According to these results, an alternative culture medium prepared by using deproteinized whey supplemented with yeast extract was efficiently used for the production of β-galactosidase through the cultivation of Kluyveromyces strains. Chitosan activated with glutaraldehyde is a suitable alternative low cost support for β-galactosidase immobilization, providing the immobilized enzyme with higher thermal, operational and storage stabilities in comparison with the soluble enzyme.
Descrição: LIMA, Ariosvana Fernandes. Imobilização de uma β-galactosidase produzida por Kluyveromyces lactis NRRL Y-1564 cultivada em soro de leite. 2012. 100 f. : Tese (doutorado) - Universidade Federal do Ceará, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, RENORBIO, Centro de Ciências, Fortaleza-CE, 2012.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/16894
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