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Título: Biodegradação do ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D) por Burkholderia sp. SMF042
Título em inglês: Biodegradation of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) by Burkholderia sp. SMF042
Autor(es): Sousa, Antonio Francisco
Orientador(es): Cunha, Rodrigo Maranguape da Silva
Palavras-chave: Herbicidas
Biorremediação
Data do documento: 2013
Citação: SOUSA, A. F. (2013)
Resumo: Bactérias do gênero Burkholderia possuem a capacidade de biodegradar inúmeros compostos considerados poluentes. Mediante o exposto, este trabalho visou a identificação molecular do isolado SMF042 oriundo de uma coleção de espécies de Burkholderia, verificar sua capacidade biodegradar o herbicida ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), identificar as enzimas envolvidas neste processo por eletroforese bidimensional (2D) e a analisar a expressão dos genes tfdA e tfdB da via TFD de biodegradação do 2,4-D. A fim de fazer a extração de RNA e proteínas foi realizado o crescimento bacteriano em dois meios de cultivo BH (meio mineral), um controle, suplementado com glicose (600 mg/L), e outro suplementado com 2,4-D (600 mg/L). A extração de RNA foi realizada na fase logarítmica enquanto a extração de proteínas foi feita no inicio da fase estacionária de crescimento bacteriano. A partir das proteínas extraídas foi determinado o mapa bidimensional de referência para cada condição. O ajuste das imagens dos géis bidimensionais, a detecção de spots protéico e a avaliação dos dados para determinar variações quantitativas e qualitativas, massa molecular (MW) e ponto isoelétrico (pI) dos spots foi feito pelo programa ImageMaster e a análise da expressão dos genes, foi realizado por qRT-PCR empregando o método da expressão relativa 2-ΔΔCT. Por meio da análise do gene 16S rRNA o isolado SMF042 foi identificado como Burkholderia phymatum. No tocante a abordagem proteômica, o número médio de spots das réplicas dos géis foi de 535 (controle) e 705 (tratado). A maior abundância de proteínas foi observado nos géis na faixa de MW 20 e 40 KDa e pH 5-6. Enzimas envolvidas na biodegradação do 2,4-D foram identificadas utilizando os valores de pI e MW do spot em comparação com o banco de dados de proteínas no ExPASy, foram elas: 2,4-D alfa KG-dependente dioxigenase (tfdA) e clorocatecol 1,2-dioxigenase (tfdC) pertencentes a via TFD e 2,4-D oxigenase da via cadRABK, ambas de biodegradação do 2,4-D. Proteínas envolvidas na resistência ao estresse químico, também foram identificadas, sendo elas: proteína GrpE e chaperona DnaK. O nível de expressão do gene tfdA aumentou cerca de 23 vezes em relação ao controle. Pelo exposto, o isolado SMF042 foi capaz de crescer em um meio contendo 2,4-D como única fonte de carbono, expressou proteínas de vias de biodegradação do 2,4-D, resistência ao estresse químico e aumentou a expressão gênico de tfdA, o que indica a importância desta bactéria na biodegradação deste poluente
Abstract: Burkholderia bacteria it has ability to biodegrade pollutants considered numerous compounds. By the above, this study aimed to identify molecular SMF042 come from an isolated collection of Burkholderia species, verify their ability to biodegrade the herbicide 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), to identify the enzymes involved in this process by electrophoresis two-dimensional (2D) and to analyze the expression of genes and TFDA tfdB track TFD biodegradation of 2,4-D. In order to make the extraction of RNA and protein bacterial growth was performed in two culture media BH (mineral medium), a control supplemented with glucose (600 mg / L) and another supplemented with 2,4-D (600 mg / L). RNA extraction was performed in the logarithmic phase while protein extraction was done at the beginning of the stationary phase of bacterial growth. The extracted proteins from two-dimensional map was determined for each reference condition. The adjustment of images of two-dimensional gels, the protein spot detection and evaluation of data to determine quantitative and qualitative changes, molecular weight (MW) and isoelectric point (pI) of the spots was made by the ImageMaster software and analysis of gene expression was qRT-PCR performed by using the method of relative expression 2-ΔΔCT. Through the analysis of the 16S rRNA isolate SMF042 was identified as Burkholderia phymatum. Regarding proteomics approach, the average number of spots of the replicas of the gels was 535 (control) and 705 (treated). The most abundant protein in the gels was observed in the range of 20 and 40 MW kDa and pH 5 and 6. Enzymes involved in the biodegradation of 2,4-D were identified using the values of pI and MW of spot against a database of proteins at ExPASy, they were: 2,4-D alpha KG-dependent dioxygenase (TFDA) and chlorocatechol 1 ,2-dioxygenase (tfdC) belonging saw PDT and 2,4-D oxygenase pathway cadRABK, both biodegradation of 2,4-D. Proteins involved in resistance to chemical stress, have also been identified, which are: protein chaperone DnaK and GrpE. The level of gene expression TFDA increased about 23 times compared to control. As shown, the isolated SMF042 was able to grow on a medium containing 2,4-D as sole carbon source expressed protein degradation pathways of 2,4-D, resistance to chemical stress and increased expression of gene TFDA, which indicates the importance of this bacterium in this pollutant biodegradation
Descrição: SOUSA, A. F. Biodegradação do ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D) por Burkholderia sp. SMF042. 2013. 100 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2013.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/17518
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