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Título: Proteínas antifúngicas do látex de Marsdenia megalantha [GOYDER & MORILLO, 1994] – Caracterização Bioquímica e mecanismos de ação
Título em inglês: Antifungal proteins Marsdenia latex megalantha [Goyder & MORILLO 1994] - Biochemical Characterization and mechanisms of action
Autor(es): Oliveira, Henrique Pinho
Orientador(es): Vasconcelos, Ilka Maria
Palavras-chave: Bioquimica
Defesa Vegetal
Fitopatógenos
Caatinga
Data do documento: 2009
Citação: OLIVEIRA, H. P. (2009)
Resumo: Marsdenia megalantha (Apocynaceae) é uma espécie encontrada sobre rochas graníticas no interior do Nordeste brasileiro. Ao sofrer injúrias, diferentes partes da planta exudam látex que, rapidamente, coagula, prevenindo perda de água e penetração de patógenos. O presente trabalho teve como objetivo avaliar as propriedades antifúngicas do látex M. megalantha e identificar proteínas relacionadas com o mecanismo de defesa das plantas contra fitopatógenos. Para isso, indivíduos dessa espécie foram coletados no município de Quixadá-CE e o látex coletado em alíquotas de tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0, contendo NaCl 0,15 M (10:1, v/v), a fim de evitar sua coagulação. Esse material foi centrifugado a 10.000 x g, 10 min, 25 ºC, dialisado exaustivamente contra água destilada e, novamente, centrifugado sob as mesmas condições. O sobrenadante, denominado de proteínas totais do látex, após diálise contra tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2, foi submetido à cromatografia em coluna de Resource-Q, equilibrada com esse mesmo tampão. Duas frações protéicas foram obtidas, uma não retida (FnRq), obtida com o tampão de equilíbrio, e uma retida (FRq), resultante do acréscimo de NaCl 0,2 M ao tampão. Na avaliação do potencial antifúngico, FnRq (22 μgP/mL) se mostrou capaz de inibir a germinação dos esporos de Fusarium solani. Quando avaliadas atividades enzimáticas relacionadas ao mecanismo de defesa das plantas, quitinases, peroxidases e proteases foram detectadas em ambas as frações oriundas da Resource Q. FnRq, após cromatografia em coluna de Superose 12 HR 10/30, resultou em dois picos (S1 e S2), com atividades enzimáticas distintas, porém ambas com potencial para inibir a germinação dos esporos de F. solani. Em S1 ficou concentrada toda atividade peroxidásica, diferentemente de S2 que reteve a atividade quitinásica. Por PADE-SDS, S1 se mostrou puro, como uma única banda de Mr de 67 kDa, diferindo de S2, cujo perfil apresentou várias bandas protéicas. Sequenciamento por degradação de Edman revelou que a extremidade NH2-terminal de S1 estava bloqueada. Avaliação dos mecanismos de ação antifúngica usando esporos de F. solani mostrou que proteínas presentes no látex de M. megalantha são capazes de interferir com o funcionamento de bombas de prótons, de induzir a produção de espécies reativas de oxigênio e de causar alterações na permeabilidade de membranas. Esses resultados apresentam o látex de M. megalantha como uma rica fonte de proteínas antifúngicas, com potencial para serem usadas na defesa contra o fitopatógeno F. solani.
Abstract: Masdenia megalantha (Apocynaceae ) is a species which grows on the hinterland in Northeast, Brazil. Upon injuries, each organ of the plant exudates a latex which quickly coagulates on exposure to air, preventing losses of water and the penetrat ion of plant pathogens. This present work had the aim to describe the antifungal properties of M. megalantha latex and to identify the related proteins in plant defense against phytopathogenous. So, latex was harvested from trees in Quix adá, Ceará, Brazil, and diluted with 0.05 M Tris - HCl, pH 8.0, containing 0.15 M NaCl (10:1, v/v) , to prevent its coagulation. The diluted latex was centrifuged (10,000 g , 10 min, 25 ºC), dialyzed extensively against water, and further centrifuged under the same above conditi ons. The supernatant, denominated Latex Proteins (LP), after exhaustive dialysis against 0.05 M sodium acetate, pH 5.2, was applied to a Resource - Q column equilibrated with this same buffer. Two different fractionswas obtained, one the non - retained protein s (FnRq), eluted with the equilibrating buffer, and the other, the retained proteins (FRq), eluted with 0.2 M NaCl in the above buffer. The FnRq (22 μfP/mL) was the only fraction able to inhibited the spore germination of the phytophatogenic fungi Fusarium solani . In addition, the evaluation of some enzymatic activities involved in plant defense mechanisms against phytopathogenous fungi such as chitinases, peroxidases and proteases were observed in both fractions from Resource - Q. FnRq, after performed in a Superose - 12 HR 10/30 column chromatography, originated another two different protein peaks (S1 and S2), showing different enzymatic activities, but both capable to inhibit the spore germination of the phytopathogenic fungi F. solani . S1 concentrated all th e peroxidase activity, whereas S2, which concentrate the chitinolityc activity. Under SDS - PAGE, S1 was presented as a purified protein band, instead of S2. Indeed, the NH2 - Terminal sequence under Edman degradation showed that S1 protein was blocked. The an tifungal action mechanisms evaluated in this work has showed that these protein presents in M. megalantha latex were able to interfere with the proton pump present in plasmatic membrane, and also to induce the ROS production, and promote alteration in the membrane permeability within the F. solani spores. These results show the latex from M. megalantha as a rich source of antifungal proteins, with potential to been used in the defense against the phytopathogenous F. solani.
Descrição: OLIVEIRA, Henrique Pinho. Proteínas antifúngicas do látex de Marsdenia megalantha [GOYDER & MORILLO, 1994] – Caracterização Bioquímica e mecanismos de ação. XIV, 114 f. : Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Fortaleza-CE, 2009.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/18168
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