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Título: Caracterização bioquímica e mecanismo de ação do efeito protetor in vivo de proteínas do látex de Calotropis procera (Ait.) R. Br. sobre infecção letal induzida por Salmonella enterica subespécie enterica sorotipo Typhimurium
Título em inglês: Biochemical characterization and mechanism of action of the in vivo protective effect of proteins laticifers of Calotropis procera (Ait.) R. Br on lethal infection induced by Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium
Autor(es): Oliveira, Raquel Sombra Basílio de
Orientador(es): Ramos, Márcio Viana
Palavras-chave: Bioquimica
Calotropis procera
Látex
Proteínas
Sepse
Calotropis procera
Latex
Proteins
Sepsis
Data do documento: 2010
Citação: OLIVEIRA, R. S. B. (2010)
Resumo: O látex da planta medicinal Calotropis procera (Apocynaceae) possui moléculas com diferentes atividades farmacológicas, dentre estas, pró- e antiinflamatória. Neste trabalho, o efeito imunomodulatório da fração de proteínas solúveis do látex (PL) foi investigado em modelos experimentais de sepse induzida por CLP e por inoculação de S. Typhimurium. Aspectos bioquímicos das proteínas do látex foram investigados e parâmetros bioquímicos, hematológicos e histopatológicos foram determinados em animais experimentais. PL exibiu um significativo efeito protetor nos animais. Uma dose de 30 mg/Kg levou à sobrevivência de até 100%, comparada com 100% de mortalidade no grupo de animais infectados e não tratados (grupo Salmonella). Este efeito foi somente observado quando PL foi administrado 24 horas antes da indução da sepse. PL não apresentou atividade antibacteriana in vitro sugerindo um mecanismo de ação indireto, possivelmente intervindo nos processos imunes. A população microbiana no fígado, baço e fluido peritoneal - local do foco infeccioso - estava similar entre todos os grupos, 4 e 24 horas após inoculação bacteriana. No sangue, entretanto, a quantidade de bactérias viáveis estava reduzida apenas nos animais tratados com proteínas do látex. O efeito protetor de PL foi revisto através de suas três sub-frações protéicas, denominadas de PI, PII e PIII, obtidas através de fracionamento por cromatografia de troca iônica em coluna de CM-Sepharose a pH 5,0. As três sub-frações protéicas apresentaram efeito protetor e de forma similar. Nem o tratamento térmico de PL (100 °C, 30 min.) ou inibição de suas proteases endógenas com iodoacetamida alterou o efeito protetor observado. O óxido nítrico (NO), um importante sinalizador molecular, estava aumentado no soro de animais do grupo Salmonella enquanto que animais protegidos com doses de PL e PI apresentaram níveis similares ao controle após 24 horas da infecção. Este resultado corroborou com a observação de que animais com sepse letal apresentaram falência na migração de neutrófilos para o foco infeccioso enquanto que, de forma evidente, animais tratados com PL ou PI favoreceram o influxo de células para a cavidade peritoneal. Além disto, nestes animais, o nível de NO estava aumentado no foco infeccioso, uma provável atividade dos neutrófilos presentes como parte de sua atividade microbicida. A atividade da adenosina desaminase (ADA) mensurada no foco infeccioso, após 4 e 24 horas de infecção, estava aumentada apenas nos animais tratados com PL ou PI, e inalterada em animais do grupo Salmonella. Plaquetopenia foi observada em animais com sepse, mas não em animais protegidos com PL ou PI. Neutrofilia e linfopenia ocorreram em animais do grupo Salmonella. Neutrofilia seria concordante com o elevado teor de NO, um inibidor da migração de neutrófilos, enquanto que a linfopenia é parte da imunossupressão estabelecida na sepse. Em animais tratados com PL ou PI foi observada neutrofilia sete dias após a infecção, sugerindo um estímulo na hematopoiese. Linfopenia, observada no início da sepse (24 h), só ocorreu aos sete dias nos animais tratados com PL ou PI. Atividade de transaminase glutâmico oxalacética estava aumentada em todos os grupos. Transaminase glutâmico pirúvica não teve atividade alterada. A atividade da lactato desidrogenase estava aumentada em todos os grupos. Análises histopatológicas do fígado e baço mostraram que os danos teciduais causados pela sepse foram retardados nos animais tratados com PL, como observado após sete dias. A análise integrada de todos os resultados sugere que as proteínas do látex modulam a resposta imunoinflamatória por mecanismo indireto, revertendo à falência da migração de neutrófilos causada pela sepse letal e, desta forma, induzem uma resposta imunológica ainda não esclarecida, que permite a sobrevivência dos animais, mesmo sob infecção. Os resultados sugerem que a modulação de NO estaria diretamente envolvida no efeito protetor final observado. As propriedades farmacológicas de PL previamente descritas em modelos clássicos de inflamação são agora confirmadas em um modelo de resposta inflamatória sistêmica resultante de um processo infeccioso previamente estabelecido.
Abstract: Latex of the medicinal plant Calotropis procera (Apocynaceae) possesses molecules displaying different pharmacological activities, including pro- and anti-inflammatory. In this study immune inflammatory modulation of the soluble protein fraction (LP) recovered from the latex was investigated in experimental models of sepsis induced by CLP and inoculation of the S. Typhimurium. Biochemical aspects of laticifers proteins were investigated and biochemical, pharmacological and histopathological parameters were evaluated in experimental animals. LP protected animals and a unique dose (30 mg/Kg; i.p.) lead to 100% survival while non-treated infected animals (Salmonella group) reached 100% mortality within 24 h. Protection was only observed when LP was given 24 earlier of infection. LP did not exhibit in vitro bactericide activity suggesting indirect mechanism of action, probably by immune modulation. After 4 and 24 h of infection bacteria was similarly disseminated in liver, spleen and peritoneal fluid, local of bacteria inoculum. However, in blood viable bacteria was reduced only in animals given laticifers proteins. The protective effect of LP was also observed in its three sub-fraction, denominated of PI, PII and PIII, obtained after protein fractionation by ion exchange chromatography on a CM-Sepharose performed at pH 5.0. Neither, heat-treatment (100 C, 30 min) nor inhibition of its endogenous proteolytic enzymes, by iodoacetamide, eliminated the protective effect of LP. Nitric oxide (NO) an important signaling molecule was augmented in serum of non-treated animals whereas it was unaltered in control and LP/PI-treated animals 24 h after infection. Increasing of NO in serum is known to directly contribute to inhibit neutrophil migration in septic animals. Accordingly, failure of neutrophil migration to the infectious focus in septic animals was confirmed. Conversely, in animals given LP and PI, influx of neutrophils was evident. In addition, NO was also elevated in the infectious focus of LP/PI treated animals, probably due neutrophil activity as part of their microbicidal activity. Activity of adenosine deaminase (ADA) was measured locally after 4 and 24 h of infection was initiated. ADA was augmented in LP/PI treated animals and unaltered in non treated animals. Thrombocytopenia was observed in non treated animals but not in LP/PI protected animals. Neutrophilia and lymphopenia were documented in non-treated animals. Neutrophilia would result of high NO content in serum, which inhibits neutrophil migration and lymphopenia is part of immune suppression caused by sepsis. Neutrophilia was observed 7 days after infection in animals given LP/PI, suggesting a hematopoiesis stimulus. Lymphopenia first observed (24 h) in septic animals was only detected after 7 days in PL/PI treated animals. Activity of oxalacetic-glutamic transaminase was altered in all groups while glutamic-pyruvic transaminase not. Lactate dehydrogenase was augmented in all groups. Histopathological examination of liver and spleen revealed tissue damage caused by sepsis, but these alterations appeared later (7 days) in PL/PI-treated animals. Results reported in this study suggest that PL modulates immune inflammatory activity in septic animals by an indirect mechanism that remains to be investigated. Activity of LP leads to animal survival, even under infection. It is proposed that LP modulates NO synthesis, reducing NO levels in serum of infected animals and abolishing the failure of neutrophil migration. The pharmacological properties of LP previously described in classical models of inflammation, is now confirmed in a model of systemic inflammatory response elicited by microbial infection.
Descrição: OLIVEIRA, Raquel Sombra Basílio de. Caracterização bioquímica e mecanismo de ação do efeito protetor in vivo de proteínas do látex de Calotropis procera (Ait.) R. Br. sobre infecção letal induzida por Salmonella enterica subespécie enterica sorotipo Typhimurium. 2010. 109 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2010.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/18172
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