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Título: Múltiplas proteínas estão envolvidas nas atividades antiinflamatória e antinociceptiva do látex da planta medicinal Calotropis procera (AIT.) R. Br
Título em inglês: Multiple proteins are involved in the anti-inflammatory and antinociceptive activities displayed by the latex of the medicinal plant Calotropis procera (Ait.) R. Br.
Autor(es): Oliveira, Jefferson Soares de
Orientador(es): Ramos, Márcio Viana
Palavras-chave: Proteínas
Látex
Proteínas laticíferas
Inflamação
Nocicepção
Calotropis procera
Latex
Laticifer proteins
Inflammation
Nociception
Calotropis procera
Data do documento: 2009
Citação: OLIVEIRA, J. S. (2009)
Resumo: A planta Calotropis procera, pertencente à família Apocinaceae, tem como uma de suas principais características a produção constitutiva de látex. Este fluido é amplamente utilizado na medicina popular, principalmente da Índia, por apresentar diversas propriedades curativas. Na literatura, o produto da extração do látex íntegro com solvente aquoso e/ou orgânico desta planta é citado por apresentar atividade antinociceptiva e antiinflamatória. Por outro lado, a mesma preparação do látex também é relatada por induzir processos inflamatórios. O presente trabalho teve como objetivo fracionar o látex da planta Calotropis procera para separar as atividades pró- e antiinflamatória; caracterizar estes mecanismos e avançar na identificação das moléculas envolvidas na atividade antiinflamatória e antinociceptiva. O látex coletado em água destilada (1:1; v/v) foi submetido às etapas de centrifugação e diálise e três frações foram obtidas (FD, PL e B) e inicialmente avaliadas quanto à presença de atividade pró- e antiinflamatória, utilizando o modelo de peritonite em ratos. A fração FD, rica em compostos de massa molecular inferior a 8.000 Da, não se mostrou antiinflamatória quando administrada por via endovenosa nos animais. Por outro lado, uma forte atividade pró-inflamatória foi observada quando esta foi injetada na cavidade peritoneal de ratos. A resposta inflamatória induzida por FD foi dependente de tempo e dose e parece estar relacionada com a presença de peptídeos detectados na fração, já que esta atividade foi diminuída quando a fração foi tratada com pronase durante 24 horas antes de sua administração nos ratos. A inflamação induzida por FD foi inibida por Dexametasona, Talidomida e Meclizina sugerindo um processo inflamatório induzido por vias de liberação de histamina e TNF-α. A fração PL, rica em proteínas, e a fração borracha (B) não foram pró-inflamatórias e apresentaram forte atividade antiinflamatória por via endovenosa. A atividade promovida por B parece estar relacionada à presença de proteínas pertencentes à fração PL, como observado em ensaio de detecção imunológica. PL inibiu o processo inflamatório induzido por FD. A atividade antiinflamatória promovida pela fração PL parece ser um evento promovido pela ação de proteínas, visto que a atividade antiinflamatória da fração foi perdida após aquecimento ou tratamento com pronase, e permaneceu ativa após precipitação com acetona. Três novas sub-frações (PI, PII e PIII) foram obtidas após aplicação da fração PL em coluna de troca iônica (CM-Sepharose Fast Flow) em pH 5,0. As sub-frações, distintas entre si, como observado através de eletroforese em gel de poliacrilamida, foram igualmente capazes de reverter a inflamação induzida por carragenina no modelo de peritonite em ratos, bem como reduzir as contorções abdominais induzidas por ácido acético, evidenciando o envolvimento de múltiplas proteínas na resposta antiinflamatória e antinociceptiva produzida pela fração PL. Ensaio de microscopia intravital revelou que PI, PII e PIII inibem o rolamento e a adesão leucocitária no mesentério de camundongos. Somente PI induziu intensa produção de óxido nítrico em ratos além de ter sido a única sub-fração capaz de reverter a resposta pró-inflamatória promovida pela fração FD, evidenciando diferentes mecanismos antiinflamatórios promovidos por diferentes proteínas do látex. A atividade antiinflamatória não foi observada quando a fração PL foi administrada por via oral nos animais. Este é o primeiro trabalho que confirma a presença de duas atividades antagonistas no látex de C. procera e que estas são promovidas por moléculas distintas passíveis de serem separadas com base em seu tamanho molecular. O conjunto de resultados aqui apresentados mostra que a atividade antiinflamatória e antinociceptiva do látex foram promovidas por moléculas protéicas
Abstract: Latex is a general term used to describe fluid exudates from plants after mechanical injury. Latex from Calotropis procera is well known for its medicinal properties mainly in Indian traditional medicine. Moreover, it has been experimentally shown that it exhibits interesting biological activities such as anti-inflammation. However its latex has been reported to induce proinflammatory responses. In the present work, (1) the latex was fractionated to segregate pro- and anti-inflammatory activities; (2) assays were carried out to characterize the mechanism of action of active fractions and (3) attempts were done to identify molecules involved in anti-inflammatory and antinociceptive activities. First, the latex was collected in distilled water (1:1; v/v) and submitted to centrifugation and dialysis steps to obtain three different fractions (FD, PL and B). These fractions were evaluated to pro- and anti-inflammatory activities using peritonitis model in rats. FD, constituted by compounds with molecular mass lower than 8,000 Da, did not exhibited anti-inflammatory activity, however induced intense neutrophil migration into peritoneal cavity of rats. The inflammation induced by FD was time and dose dependent. Moreover, it was seen that previous injection of Dexamethasone, Thalidomide and Meclizine in animals inhibited FD inflammatory responses suggesting that inflammation triggered by this fraction occurs through histamine and TNF-α release. Peptides, present in FD as shown in electrophoresis, should be involved in inflammation responses displayed by FD since such activity was diminished after 24 hour pronase treatment. Fractions PL, and B did not induce inflammatory response when injected into peritoneal cavity of animals, however intravenous injection displayed strong anti-inflammatory activity against inflammation induced by carrageenan. The anti-inflammatory activity promoted by B seems to be related to PL proteins present in B. PL fraction inhibited neutrophil migration trigged by FD. PL anti-inflammatory activity ought to be related to proteins since such activity was completely abolished after heat or pronase treatment and it still remained after acetone precipitation. Three protein sub-fractions (PI, PII and PIII) were recovered after PL chromatography on ion-exchange column (CM-Sepharose Fast flow) at pH 5.0. In spite of the fact that PI, PII e PIII were seen to be different by electrophoresis they were equally able to inhibit neutrophil migration induced by carrageenan in rats as well as abdominal writhes stimulated by acetic acid in mice. Intravital microscopy assay revealed that, PI, PII and PIII inhibit both leucocyte rolling and adhesion in mice mesenteric tissues. In addition, PI was able to induce nitric oxid production and inflammation induced by FD. These results show that multiples proteins in PL display anti-inflammatory activity and they act at different pathway of inflammation. Several experiments were performed aiming to detect the anti-inflammatory activity of PL when it was administered by oral route however, we did not obtain success. This is the first report which confirms the presence of pro- and anti-inflammatory activities and it shows that such activities are displayed by compounds suitable to be fractionated on the basis of their molecular size. In addition, these results show that anti-inflammatory and antinociceptive activities are displayed by proteins present in the latex
Descrição: OLIVEIRA, Jefferson Soares de. Múltiplas proteínas estão envolvidas nas atividades antiinflamatória e antinociceptiva do látex da planta medicinal Calotropis procera (AIT.) R. Br. 2009. 101 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2009.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/18176
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