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Título: Caracterização bioquímica, biológica e estrutural de uma quitinase recombinante de chromobacterium violaceum
Título em inglês: The biochemical, biological and structural characterization of a recombinant chitinase from chromobacterium violaceum
Autor(es): Lobo, Marina Duarte Pinto
Orientador(es): Grangeiro, Thalles Barbosa
Palavras-chave: Bioquimica
Biotecnologia vegetal
Bactérias
Cristalização
Biotechnology
Bacteria
Crystallization
Enzimas - Aplicações industriais
Engenharia genética
Data do documento: 2012
Citação: LOBO, M. D. P. (2012)
Resumo: Chromobacterium violaceum é uma bactéria Gram-negativa, saprófita, não patogênica e de vida livre. O seqüenciamento completo do genoma dessa espécie revelou muitos genes codificando produtos com potenciais aplicações em diversas áreas. Dentre esses produtos, estão várias quitinases. Quitinases, enzimas capazes de degradar a quitina, um biopolímero de N-acetil-β-D-glucosamina bastante insolúvel, são de grande interesse biotecnológico, podendo ser utilizadas para converter quitina em derivados úteis, e também para o controle de fungos e insetos que causam danos em culturas agrícolas. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar bioquímica, biológica e estruturalmente uma quitinase recombinante (CV2935), da família 18 das glicosídeo hidrolases, de C. violaceum ATCC 12472. A ORF codificando a proteína CV2935 foi amplificada por reação em cadeia da polimerase (PCR) e clonada nos vetores pET303/CT-His e pPICZαA, para expressão em Escherichia coli e Pichia pastoris, respectivamente. Em ambos os sistemas, a enzima foi secretada para o meio de cultura, na sua forma solúvel e funcional, sendo purificada a homogeneidade por cromatografia de afinidade em matriz de quitina, seguida de cromatografia de exclusão molecular em matriz de Superdex75. Os rendimentos da quitinase pura, expressa em E. coli e P. pastoris, foram 2,6 e 44 mg por litro de cultura, respectivamente. A quitinase produzida em ambos os microorganismos mostrou atividade ótima em pH 3,0 e foi ativa quando tratada a temperaturas de até 60 °C. A enzima produzida em P. pastoris (45 kDa) foi N-glicosilada, como revelado por coramento com reagente de Schiff e digestão com N-glicosidase F, mostrando-se ligeiramente mais termoestável do que a enzima não glicosilada, produzida em E. coli (43 kDa). A rCV2935 apresentou atividade hidrolítica (endoquitinásica) frente a quitina coloidal, matriz de carapaça de caranguejo obtida comercialmente, glicol-quitina (em gel SDS-PAGE), substratos sintéticos solúveis contendo p-nitrofenol, além de apresentar pequena atividade quitosanásica. Os espectros de fluorescência revelaram que as proteínas foram produzidas na sua conformação enovelada. A enzima teve sua estrutura cristalográfica resolvida a uma resolução de 2.1Å e seu domínio catalítico apresentou um dobramento do tipo barril (β/α)8 (barril TIM) e resíduos essenciais para catálise conservados, características essas, comuns às proteínas da mesma família. A quitinase recombinante retardou o crescimento do fungo fitopatogênico Rhizoctonia solani, e, em bioensaios com o caruncho Callosobruchus maculatus, a rCV2935 possivelmente interferiu com a alimentação do inseto, o que acarretou na diminuição do peso dos mesmos. Os estudos bioquímicos, biológicos e estruturais da rCV2935 poderão ser úteis para aplicação biotecnológica dessa enzima.
Abstract: Chromobacterium violaceum is a Gram-negative, saprophytic, non-pathogenic and free living bacterium. The complete sequencing of its genome has revealed many genes encoding products of biotechnological interest. Among these products are several chitinases. Chitinases, enzymes capable of degrading chitin, an insoluble polymer of β(1,4)-linked N-acetyl-β-D-glucosamine (GlcNAc), are of great biotechnological interest, because they can be used to convert chitin in useful derivatives as well as being exploited for the control of fungi and insects that cause damages in crops. This study aimed to carry out the biochemical, biological and structural characterization of a recombinant chitinase, belonging to family GH18, from C. violaceum ATCC 12472. The ORF CV2935 was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into the vectors pET303/CT-His and pPICZαA, for expression in Escherichia coli and Pichia pastoris, respectively. In both systems, the enzyme was secreted into the culture medium, in its soluble and functional form, and purified to homogeneity by affinity chromatography on a chitin matrix followed by size-exclusion chromatography on Superdex75 matrix. The yields of pure chitinase expressed in E. coli and P. pastoris were 2.6 and 44 mg per liter of culture, respectively. The recombinant chitinase produced in both microrganisms showed optimal activity at pH 3.0 and it was active after treated at temperatures up to 60 °C. The enzyme produced in P. pastoris (45 kDa) was N-glycosylated as revealed by Schiffʼs reagent and digestion with N-glycosidase F. Moreover, the glycosylated chitinase was found to be slightly more thermostable than the enzyme produced in E. coli (43 kDa). The rCV2935 showed hydrolytic activity against colloidal chitin, crab shell, and synthetic substrates containing p-nitrophenol. It was also able to hydrolyse glycol-chitin in SDS-PAGE and showed low chitosanase activity. The fluorescence spectra revealed that the proteins were produced in their folded conformation. The crystal structure of the recombinant chitinase produced in P. pastoris was determined by X-ray crystallography at a resolution of 2.1Ǻ. Its catalytic domain adopts an (β/α)8 triose-phosohate isomerase (TIM) barrel fold, and the residues essential for catalysis are conserved. The recombinant chitinase reduced the growth of the phytopathogenic fungus Rhizoctonia solani, and bioassays with cowpea weevil Callosobruchus maculatus showed that the rCV2935 possibly interfered with the insect feeding, which resulted in decreased weight of adults. The biochemical, biological and structural studies of rCV2935 may be useful for biotechnological application of this enzyme.
Descrição: LOBO, Marina Duarte Pinto. Caracterização bioquímica, biológica e estrutural de uma quitinase recombinante de chromobacterium violaceum. 2012. 155 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2012.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/18721
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