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Título: Aspectos bioquímicos, toxicológicos e alergênicos do látex da planta Calotropis procera (Ait.) R. BR.
Título em inglês: Biochemical, Toxicological and Allergenic Aspects of the Latex from the Plant Calotropis procera (Ait.) R. Br.
Autor(es): Aguiar, Valéria Cavalcanti de
Orientador(es): Ramos, Márcio Viana
Palavras-chave: Bioquímica
Proteínas vegetais
Plantas lactíferas
Digestibilidade
Toxicidade
Alergenicidade
Data do documento: 2006
Citação: AGUIAR, V. C. (2006)
Resumo: O látex da planta lactífera Calotropis procera (Ait.) R. Br. é um composto biologicamente ativo importante que apresenta propriedades relevantes como as atividades antiinflamatória e antidiarréica, embora já tenha sido previamente mostrado que esse látex produz efeitos tóxicos consideráveis em animais. Um outro fato é que não é sabido, ainda, se as proteínas do látex de C. procera produzem efeitos alergênicos, assim como as proteínas do látex de Hevea brasiliensis. O potencial do látex como um fármaco, por essa razão, depende da separação das propriedades curativas das propriedades tóxicas e alergênicas, mas não existe investigação científica nessa área. O presente estudo teve como objetivo investigar aspectos bioquímicos, toxicológicos e alergênicos do látex da planta C. procera, através do estudo da digestibilidade in vitro e in vivo, avaliação da toxicidade subcrônica e aguda por via oral e análise da indução de resposta imune pelas vias subcutânea e oral das suas frações. O látex foi fracionado em três frações distintas de acordo com a sua solubilidade em água e tamanho molecular. As frações foram assim denominadas: proteínas do látex (PL), correspondendo às principais proteínas do látex; proteínas da diálise (PD), representando as substâncias de baixa massa molecular; e borracha do látex (BL) que é altamente insolúvel em água. A fração PL foi investigada, com relação a alguns aspectos bioquímicos, como seu perfil protéico por PAGE-SDS e análise da composição de seus aminoácidos. As proteínas do látex também foram submetidas à digestão in vitro com as enzimas proteolíticas pepsina, tripsina, quimiotripsina e protease de Streptomyces griseus e a digestibilidade in vitro foi avaliada por cromatografia de filtração em gel ou PAGE-SDS. A digestibilidade in vivo de PL foi analisada quando animais experimentais ingeriram essa fração por 35 dias. O volume de PL consumido foi registrado diariamente e amostras das fezes dos animais coletadas, tratadas e submetidas à PAGE-SDS e ensaios de imunodifusão radial dupla de Ouchterlony, com anticorpos policlonais contra PL. Com relação aos aspectos toxicológicos, a fração PL foi oralmente administrada a animais experimentais por 35 dias, para a avaliação da toxicidade subcrônica. Aumentos na massa corpórea foram registrados e amostras sangüíneas foram analisadas semanalmente. Após o período experimental, os animais foram sacrificados e um número de parâmetros bioquímicos e fisiológicos foram determinados. Esses incluíram determinações séricas de glicose sangüínea, colesterol total, HDL-colesterol, triglicerídeos, testes da função hepática (proteínas totais, albumina, alanina aminotransferase – ALT e aspartato aminotransferase – AST), testes da função renal (uréia e creatinina), contagens total e diferencial de leucócitos sangüíneos e do fluido peritonial e análise das proteínas séricas por PAGE-SDS. Os animais tiveram seus órgãos vitais (fígado, rins, baço, intestino delgado, intestino grosso, pâncreas e estômago) dissecados e as massas frescas relativas foram determinadas. Na avaliação da toxicidade aguda, a fração PL foi administrada por via oral a animais experimentais e a monitoração de alterações comportamentais desses animais também foi realizada. Quanto aos aspectos alergênicos, respostas imunológicas do látex de C. procera foram investigadas pelas vias oral e subcutânea em camundongos. Anti-soros contra as frações PL, PD e BL foram analisados quanto a IgG e IgA por ELISA, enquanto IgE e IgG1 foram monitoradas por anafilaxia cutânea passiva (PCA) em ratos e camundongos, respectivamente. Os perfis protéicos das frações PL e BL foram analisados por PAGE-SDS. Com relação aos resultados dos aspectos bioquímicos, a fração PL possui uma quantidade apreciável de proteínas, baixo conteúdo de aminoácidos sulfurados (metionina e cisteína) e um número considerável de aminoácidos (arginina, lisina, fenilalanina e tirosina) que representam sítios de clivagem para as enzimas proteolíticas animais usadas. A fração PL foi digerida pela ação da pepsina, tripsina e quimiotripsina como revelado por análises de filtração em gel e PAGE-SDS. A digestão completa das proteínas do látex foi facilmente obtida pelo tratamento com a protease de S. griseus. Anticorpos policlonais de coelho produzidos contra PL não apresentaram reação cruzada com as moléculas presentes nas fezes dos ratos experimentais. Padrões semelhantes de eletroforese foram observados para as quantidades desprezíveis de proteína observadas nos materiais fecais dos animais controle e experimentais. Quanto aos resultados da avaliação da toxicidade subcrônica, nenhuma morte foi observada durante o experimento. Animais controle e experimentais apresentaram taxa de crescimento semelhante e os órgãos vitais exibiram massas frescas relativas similares. As funções hepática e renal, parâmetros glicêmicos e lipidêmicos séricos situaram-se em níveis normais. Os padrões protéicos eletroforéticos dos soros dos animais controle e experimental exibiram perfis muito similares. A fração PL não induziu inflamação aguda na cavidade peritonial dos ratos, como determinado pelas contagens total e diferencial de leucócitos. O resultado mais relevante detectado foi um aparente efeito proliferativo das proteínas do látex sobre os linfócitos sangüíneos que tenderam a aumentar, enquanto os neutrófilos permaneceram em nível normal. Deve ser enfatizado que os animais experimentais exibiram comportamento, aspectos morfológicos e bioquímicos normais, indicando ser improvável que os mesmos estivessem sob qualquer condição patológica ou infecciosa. Portanto, o incremento da população de linfócitos no soro sangüíneo deve ser atribuído a um efeito notável das proteínas do látex e não a qualquer evento prejudicial. A fração PL foi incapaz de induzir toxicidade aguda, pois nenhuma mudança comportamental foi observada nos animais experimentais. Com relação aos resultados dos aspectos alergênicos, nenhuma das frações induziu aumentos nos níveis de anticorpos, quando os camundongos receberam as frações do látex por via oral e, portanto, não desenvolveram alergia. Entretanto, anti-soros de camundongos sensibilizados com PL e BL por administração subcutânea apresentaram resposta imunológica considerável, e PD não induziu síntese de anticorpos. O nível de IgG aumentou consistentemente contra PL e BL, enquanto a resposta de IgA foi detectada unicamente contra PL. PL e BL induziram reações de PCA muito fortes, sugerindo que ambas as frações contêm substâncias do látex envolvidas na alergenicidade. Além disso, a análise protéica de PL e BL sugere que BL ainda retém proteínas residuais, co-precipitadas com a borracha, abundantemente encontradas na fração PL, que poderiam explicar as alergenicidades semelhantes. Nenhuma reação de IgG1 foi detectada em quaisquer dos anti-soros testados. Conclui-se que as proteínas do látex foram parcialmente susceptíveis à proteólise em ensaios in vitro e, ou foram digeridas e absorvidas, ou foram absorvidas íntegras, quando ingeridas em ensaios in vivo. Eventos tóxicos ou letalidade associados ao látex, como descritos na literatura, não estão relacionados com a fração PL. A fração PL produziu efeito proliferativo parcial sobre as células mononucleadas, principalmente linfócitos e não induziu resposta inflamatória aguda, quando administrada pela via oral. Efeitos alergênicos puderam ser detectados, por via subcutânea, com as frações PL e BL, e não foram observados por via oral. Evidências para uma possível tolerância sistêmica às proteínas do látex por via oral foram fornecidas. As proteínas do látex podem atuar como imunoestimulantes. As proteínas do látex permanecem uma fonte interessante de moléculas biologicamente ativas que devem ser estudadas em detalhe quanto às suas propriedades estruturais, funcionais e aplicativas.
Abstract: The latex of the lactiferous plant Calotropis procera (Ait.) R. Br. is an important biologically active compound that displays relevant properties like antiinflammatory and antidiarrhea activities, although the latex has previously been shown to produce considerable toxic effects on animals. Another question is that it is not known yet whether the latex proteins from C. procera induce allergenic effects, just like the latex proteins from Hevea brasiliensis. The potential of the latex as a pharmaceutical, therefore, depends on separating the curative properties from the toxic and allergenic properties, but there has been a lack of scientific investigation in this area. The objective of the present study was to investigate biochemical, toxicological and allergenic aspects of the latex from the plant C. procera, through the study of in vitro and in vivo digestibility, evaluation of acute and subchronic toxicity by oral route, and analysis of immune response induction by subcutaneous and oral route of its fractions. The latex was fractionated into three distinct fractions according to their water solubility and molecular size. The fractions were named as: latex proteins (LP), corresponding to the major latex proteins; dialysis proteins (DP), representing low molecular size substances; and rubber latex (RL), which was highly insoluble in water. LP fraction was investigated in some biochemical aspects, like its protein profile by SDS-PAGE analysis and its amino acid composition determination. Latex proteins were also subjected to in vitro digestion with trypsin, chemotrypsin, pepsin and Streptomyces griseus protease and in vitro digestibility was evaluated by gel filtration and SDS-PAGE analysis. The in vivo digestibility of LP was analyzed when experimental animals ingested this fraction for 35 days. The volume uptake of LP was recorded daily and samples of fecal material from animals were collected, treated and submitted to SDS-PAGE analysis and radial double immunodifusion assays, with polyclonal antibodies raised against LP. In relation to toxicological aspects, LP fraction was orally administered to experimental animals for 35 days, to allow subchronic toxicity evaluation. Increases in body mass were recorded and blood samples were analyzed weekly. After the test period, the animals were sacrificed and a number of biochemical and physiological parameters determined. These included sera determinations of blood glucose, total cholesterol, HDL-cholesterol, triglycerides, hepatic function tests (total proteins, albumin, alanine aminotransferase – ALT and aspartate aminotransferase – AST), renal function tests (urea and creatinin), total and differential leukocyte counts in blood and peritoneal fluid and analysis of sera proteins by SDS-PAGE. Animals had internal key organs (liver, kidneys, spleen, small intestine, large intestine, pancreas and stomach) dissected and the relative fresh masses were determined. In the acute toxicity evaluation, LP fraction was administered by oral route to experimental animals and behavioral changes in animals were also monitored. With reference to allergenic aspects, immunological responses of latex from C. procera were investigated by oral and subcutaneous routes in mice. Anti-sera against LP, DP and RL fractions were assayed for IgG and IgA titration by ELISA, while IgE and IgG1 were accessed by passive cutaneous anaphylaxis (PCA) in rats and mice, respectively. Protein profiles of LP and RL fractions were analyzed by SDS-PAGE. Concerning biochemical aspects results, LP fraction possesses appreciable amount of protein, low content of sulphurated amino acids (methionine and cysteine) and a considerable number of amino acids (arginine, lysine, phenylalanine and tyrosine) that represent cleavage sites to animal proteolytic enzymes studied. LP fraction was digested by the action of pepsin, trypsin and chemotrypsin as revealed by gel filtration and SDS-PAGE analyses. The full LP digestion was easily achieved by S. griseus protease treatment. Rabbit polyclonal antibodies raised against LP failed to detect cross-reactive molecules in faeces of experimental rats. Similar patterns of electrophoresis were observed for the negligible amounts of protein observed in the fecal materials of control and test animals. With relation to subchronic toxicity evaluation results, no death was observed during the experiment. Experimental and control animals presented similar growth rate and key organs exhibited similar relative fresh masses. Hepatic and renal functions, sera glycemic and lipidemic parameters were determined to be at normal levels. Likewise, the electrophoretic protein patterns of sera from untreated and treated animals exhibited quite similar profiles. Uptake of latex proteins did not induce acute inflammation into peritoneal cavity of rats as determined by the total and differential leukocytes counts. The most relevant result discovered was an apparent proliferative effect of the latex proteins upon blood lymphocytes that tended to increase, whilst neutrophils remained at normal level. It should be emphasized that the experimental rats were normal in their behavior, morphological and biochemical aspects, indicating that it is unlikely that they were under any pathological or infectious condition. Therefore, the increment of lymphocytes population in the blood serum should be attributed to the staking effect of the latex proteins rather than any harmful event. LP fraction was unable of presenting acute toxicity in experimental animals, because no behavioral changes in animals were observed. Concerning allergenic aspects results, none of the fractions induced antibodies level increases when mice received latex fractions by oral route and thus, did not develop allergy. Nonetheless, anti-sera of mice sensitized with LP and RL by subcutaneous administration displayed considerable immunological response, while DP did not induce antibodies synthesis. IgG level augmented consistently against LP and RL, while IgA response was detected to LP solely. LP and RL induced very strong PCA reactions suggesting that both fractions would contain latex substances involved in allergenicity. Furthermore, protein analysis of LP and RL suggests that RL still retain residual proteins, co-precipitated with rubber, abundantly found in LP, that could explain its similar allergenicity. No IgG1 reaction was detected in any of the anti-sera tested. It can be concluded that latex proteins were partially susceptible to digestive proteolysis when accessed by in vitro assays, and were digested and absorbed, or were absorbed in its intact form, when ingested and analyzed by in vivo tests. Toxic events or lethality associated with latex, as described in the literature, are not related to LP fraction. Latex proteins produced partial proliferative effect upon mononuclear cells, mainly lymphocytes and did not induce an acute inflammatory response, when administered by oral route. Allergenic effects could be detected, by subcutaneous route, with LP and RL fractions, and were not observed by oral route. Evidences for an inducible tolerance acquired to latex proteins by oral route were provided. Latex proteins may act as immune stimulants. The proteins from the latex remain an interesting source of biologically active molecules that should be studied in detail for their structural, functional and applicative properties.
Descrição: AGUIAR, Valéria Cavalcanti de. Aspectos bioquímicos, toxicológicos e alergênicos do látex da planta Calotropis procera (Ait.) R. BR. 2006. 182 f. Tese (Doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2006.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/18813
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