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Título: Toxinas protéicas de sementes de soja [Glycine Max (L.) Merr.]: aspectos moleculares e funcionais
Título em inglês: Toxic proteins from soybean seeds [Glycine max (L.)Merr.]: molecular aspects and functional analysis
Autor(es): Oliveira, Hermógenes David de
Orientador(es): Vasconcelos, Ilka Maria
Palavras-chave: Fungos fitopatogênicos
M. incognita
SBTX
SYTX-2
Glycine max
Bioquimica
Glycine max
SYTX-2
SBTX
Plant defense
M. incognita
Phytopathogenic fungi
Data do documento: 2009
Citação: OLIVEIRA, H. D. (2009)
Resumo: A soja (Glycine max) é uma espécie de grande valor econômico para o Brasil dada a multiplicidade de uso de seus grãos na alimentação animal e na indústria. Embora o Brasil seja o segundo maior produtor mundial dos grãos, as perdas na produtividade em campo ainda são consideráveis, principalmente àquelas causadas por nematóides do gênero Meloidogyne e por fungos fitopatogênicos. Mesmo com a existência de alternativas químicas para o controle dessas espécies, bem como com a existência de genótipos resistentes, as perdas agrícolas ainda são consideráveis, mostrando que a busca por mecanismos naturais de resistência ambientalmente seguros são práticas necessárias para o controle de pragas e patógenos e para a melhoria na produtividade. Este trabalho objetivou caracterizar bioquímica e funcionalmente duas toxinas protéicas isoladas de sementes de soja, bem como avaliar os seus papéis na defesa contra patógenos de importância agronômica para essa espécie. Foi mostrado experimentalmente que SYTX-2 (28 kDa) é uma proteína ácida encontrada em duas isoformas (27,3 e 27,2 kDa) de pI’s 5,11 e 5,24, as quais apresentam a mesma extremidade NH2-Terminal (KTISSEDSPFFNCREK). A análise por dicroísmo circular mostrou que a SYTX-2 apresenta um espectro típico de proteínas que apresentam α-hélice e folhas-β, sendo essa estrutura semelhante àquela já descrita para a SBTX. Esses padrões são gradualmente perdidos quando a proteína é aquecida de 25 a 95 ºC. Os espectros de emissão em 280 e 295 nm (323 e 313 nm, máximo) mostraram padrões típicos de resíduos de triptofano presentes no interior da estrutura terciária. SYTX-2 é uma hemilectina capaz de aglutinar indiretamente eritrócitos de coelho em presença de anticorpos policlonais anti-SYTX-2, sendo essa atividade inibida por D-manose. Além disso, in vitro, SYTX-2 apresentou atividade ribonucleásica, cuja atividade específica (1821,42 ± 3,34 UA. h-1 mgP) foi semelhante àquela descrita para a ribonuclease de raízes de V. unguiculata. Foi observado que SYTX-2 está presente na casca das sementes em teores menores do que os observados para os cotilédones, além de se distribuir também em raízes, caules e folhas. As raízes jovens apresentam os maiores teores de SYTX-2 (62,62 ± 10,10 µg de SYTX-2/g de tecido) sendo essa expressão triplicada em tecidos adultos (195,12 ± 35,54 µg/g de tecido). Em pH 5,0 essa proteína é exsudada das sementes ao longo de 24 h, sendo o pico de exsudação mostrado 18 h após o contato com o tampão (6,16 ± 0,08 µgP de SYTX-2/semente ). Tal como descrito para muitas proteínas de defesa, SYTX-2 foi induzida 6 h após a injúria mecânica de folhas (de 6,7 para 10,46 µg de SYTX-2/ g de tecido), retornando aos valores normais 24 h após a lesão. In vitro SYTX-2 apresentou uma potente atividade nematicida contra M. incognita Raça 4, induzindo a mortalidade de 85% dos J2 6h após incubação com a proteína, e de 100% após 24 h. Essa toxina também foi capaz de inibir (20%) o crescimento de C. albicans, embora não tenha sido efetiva em inibir a germinação de esporos de fungos fitopatogênicos (R. solani, Phomopsis sp. e F. solani f.sp glycines). Este trabalho também descreve o isolamento, a clonagem e a caracterização do cDNA da subunidade de 27 kDa da SBTX (44 kDa). O cDNA foi isolado a partir de um pool de RNA extraído de sementes 15, 25 e 35 dias após a antese, utilizando iniciadores desenhados a partir do NH2-terminal das duas subunidades da proteína (27 e 17 kDa). Evidências experimentais sugerem fortemente que as duas subunidades da proteína são codificadas por genes diferentes. A subunidade de 27 kDa da SBTX apresenta um cDNA de 815 pb, composto por uma ORF de 660 nucleotídeos, codificante para uma proteína com 219 resíduos de aminoácidos. A sequência do cDNA da SBTX foi detectada em dois cromossomos (04 e 06) e a busca por EST’s para essa proteína, mostrou que além de ser expressa em todo o vegetal, níveis elevados de transcritos são observados após a infecção contra P. sojae e F. solani f. sp. glycines, evidenciando seu importante papel na defesa contra fungos fitopatogênicos. A sequência deduzida de aminoácidos da subunidade de 27 kDa apresenta um peptídeo sinal de 26 resíduos de aminoácidos, clivado para a produção da proteína madura, que apresenta, portanto, massa molecular de 21,7 kDa e pI 9,3, sendo uma proteína básica. Na sequência de aminoácidos da subunidade de 27 kDa também foram identificados: um resíduo de cisteína, envolvido na formação de uma ponte dissulfeto com a subunidade de 17 kDa, 11 sítios de fosforilação em Ser, Thr ou Tyr, 8 sítios de glicosilação para GlcNAc e um sítio para adição de oligossacarídeos tipo mucina (GalNAc). A toxina também apresenta sítios de clivagem para pepsina, tripsina e quimiotripsina que podem justificar a ausência de toxicidade observada em camundongos após administração oral. SYTX-2 e SBTX foram mostradas através de uma caracterização estrutural ainda mais completa que as descritas por Sousa (2006) e Siebra (2004) e as informações obtidas permitiram definir que essas proteínas são parte importante da defesa da soja contra fungos fitopatogênicos e nematóides. Além de inéditos e de extrema relevância, todos esses dados darão subsídios para estudos posteriores que objetivem, para SYTX-2, determinar sua microestrutura protéica e isolamento gênico e, para SBTX, realização de projetos futuros, visando o desenvolvimento de plantas transgênicas com uma maior resistência a fungos
Abstract: Soybean provides significant sources of fatty acids and proteins for human and animal nutrition and also has non-food uses. Conditions in almost all cultivated land are sub-optimal for plant growth as a result of the increasing incidence of diseases, even in developed agricultural systems. To meet these challenges, genes and proteins that control their resistance to a wide range of pathogens need to be identified and characterized to facilitate improvements in crop productivity. The main focus in this thesis has been to characterize (providing basic information about biochemical characteristics) and study the functional role of SYTX-2 (28 kDa) and SBTX (44 kDa), two toxic proteins isolated from soybean seeds, in plant defense against pathogens. The SYTX-2 was purified by a combination of ammonium sulphate fractionation and two chromatographic steps. Bidimensional electrophoresis of this protein revealed the presence of two spots (27.3 e 27.2 kDa), with isoeletric points values corresponding to 5.11 and 5.24, respectively, exhibiting the same N-terminal sequence (KTISSEDSPFFNCREK). SYTX-2 has also ribonuclease activity (1821.42 ± 3.34 UA. h-1 mgP), similar to that described in Vigna unguiculata leaves. The CD spectrum of SYTX-2 presents an alpha-beta profile spectrum, similar to the structure described to SBTX. Regarding to the temperature exposure, monitored by CD, it was observed that the structure of SYTX-2 is vulnerable to the temperatures above 40 ºC. The fluorescence spectra of Soyatoxin-2 marked a maximum emission of fluorescence at 323-333 nm and confirmed that the tertiary structure of this protein was correctly folded. SYTX-2 behaves as a hemilectin: it does not directly promote agglutination of red blood cells, but toxin-treated erythrocytes are readily agglutinated in the presence of anti-SYTX-2 antibodies. ELISA assays showed that SYTX-2 was exuded during seed imbibition, the maximum level of exuded toxin (6.16 ± 0.08 µg/seed) detected being at 18 h after the start of imbibition. The expression profiles of SYTX-2 in various soybean tissues were investigated with ELISA assay or Dot Blot analysis. The expression analysis suggested that SYTX-2 was clearly detected in seed coat, leaves, roots and also in stems. However, expression of SYTX-2 in roots is higher than that in leaves and stems. A strong induction of SYTX-2 expression was also observed in wounded leaves 6 h after treatment and it decreased thereafter. In vitro, antifungal activity of SYTX-2 was not detected against R. solani, Phomopsis sp. and F. solani f.sp glycines, but this protein inhibits C. albicans growth. Nematicidal effects of SYTX-2 were studied in vitro against Meloidogyne incognita nematode and the toxin (11µg/nematode) showed a high nematicidal activity, with the mortality of 85%, after six hours contact and of 100%, after 24 h of incubation. This work also describes the isolation, sequencing and functional analysis of cDNA (815 pb) encoding 27 kDa subunit of soybean toxin (SBTX). CDNA was amplified using a forward primer designed based on the N-terminal sequence of the toxin in combination of primer AP. The genomic location of the 27 kDa SBTX subunit SBTX was preliminarily determined with the mapped soybean ESTs database (www.phytozome.net) at Gm04 and Gm06 chromosome of soybean and thus may have two copies per genome. The deduced protein sequence of 219 amino acids (MW of mature protein 21.7 kDa, pI 9.3) included an N-terminal signal peptide. EST’s encoding 27 kDa subunit SBTX were present in cotyledons, leaves, and seedlings and the expression of 27 kDa subunit SBTX was also induced in tissues by P. sojae and F. solani f. sp. glycines infection and by abiotic stress. In addition to these blocks, the 27 kDa deduced protein sequence contains a putative Ser/Tyr/Thr phosphorylation and also contains eight potential N-linked glycosylation sites and a threonine/serine-rich region which is a potential site for attachment of O-linked carbohydrate. Potential sites for pepsin, trypsin and chymotrypsin hydrolysis were also detected. The results add a new dimension to toxins SBTX and SYTX functionalities and support the concept that these proteins act protecting soybean against pathogens
Descrição: OLIVEIRA, Hermógenes David de. Toxinas protéicas de sementes de soja [Glycine Max (L.) Merr.]: aspectos moleculares e funcionais. 2009. 179 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2009.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/18878
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