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Título: Purificação, caracterização bioquímica e potencial quimiopreventivo de um novo inibidor de quimotripsina de sementes de Enterolobium contortisiliquum (Vell.) Morong
Título em inglês: Purification, Biochemical Characterization and chemopreventive potential hum new inhibitor of chymotrypsin Enterolobium seeds contortisiliquum (Vell.) Morong
Autor(es): Bezerra, Lady Clarissa Brito da Rocha
Orientador(es): Carvalho, Ana de Fátima Fontenele Urano
Coorientador(es): Clemente, Alfonso
Palavras-chave: Bioquímica
Câncer
Timbaúba
Inibidor de protease
Protease inhibitor
Inibidores enzimáticos
Data do documento: 2014
Citação: BEZERRA, L. C. B. R. (2014)
Resumo: Inibidores de proteases são proteínas que inibem a atividade catalítica de enzimas, sendo bastante comuns em sementes de plantas. As proteases desempenham papéis centrais no desenvolvimento de muitas doenças. O controle de sua atividade realizado por inibidores de proteases despertou o interesse sobre estas moléculas como agentes quimiopreventivos, especialmente sobre o câncer. Os efeitos anticarcinogênicos das sementes de leguminosas presentes comumente na dieta, bem como de espécies vegetais subexploradas, têm sido extensivamente investigados. O objetivo deste trabalho foi purificar, caracterizar bioquimicamente e avaliar o potencial quimiopreventivo in vitro de inibidores de proteases de sementes de Enterolobium contortisiliquum, utilizando como modelo células de adenocarcinoma colorretal humano. Foram purificados dois inibidores de proteases denominados EcCI e EcTI. Através da sequência N-terminal, EcCI foi identificado como um inibidor da família Kunitz. EcTI foi identificado, por meio de peptide mass fingerprinting e por análise da sequência N-terminal, como aquele descrito previamente na literatura (NCBI Protein BLAST; número de acesso: sp|P86451.1|ITRY_ENTCO). Suas massas moleculares determinadas por SDS-PAGE e espectrometria de massas são, respectivamente, 18,5 kDa e 19.710,4 Da (EcCI); 20,2 kDa e 19.813,22 Da (EcTI). Ambos os inibidores são formados de duas subunidades proteicas e apresentam isoformas cujos pI’s são ácidos, entre 5 e 6. Frente a quimotripsina, EcCI é um inibidor não competitivo e apresenta ki de 8 x 10-8 M, enquanto EcTI é inibidor competitivo com ki de 48 x 10-8 M. Frente à tripsina, EcTI apresenta inibição não competitiva e ki de 2,8 x 10-8 M. EcCI e EcTI apresentam atividade inibitória de quimotripsina alta (93%) e moderada (38%), respectivamente. Apenas EcTI foi capaz de inibir a tripsina (100%). EcCI e EcTI apresentam alta atividade inibitória de elastase neutrofílica (85 e 75%, respectivamente). Os dois inibidores inibiram sutilmente a elastase pancreática (ca. de 10%) e nenhum foi capaz de inibir papaína e bromelaína. Os dois inibidores apresentam alta estabilidade à variação de temperatura (de 37 a 70 °C para EcCI e de 37 a 60 °C para EcTI), pH (2 a 12) e concentração de DTT (de 1 a 10 mM para EcCI e de 1 a 100 mM para EcTI). EcCI e EcTI inibiram a proliferação de células de adenocarcinoma colorretal humano da linhagem HT29 com CI50 de 35,5 e 20,4 x 10-6 M, respectivamente, indicando que esses inibidores apresentam bom potencial quimiopreventivo e, portanto, são moléculas bastante interessantes do ponto de vista biotecnológico.
Abstract: Protease inhibitors are proteins with the intrinsic ability to inhibit catalytic activity of enzymes and are very common in plant seeds. Proteases play a major role in development of several diseases. The control of their activity by protease inhibitors have increased interest on these molecules as chemopreventive agents, specially for cancer. The anticarcinogenic effects of legume seeds present in human diet as well as those of underexploited plant species have been extensively investigated. This study aimed to purify, perform biochemical characterization and evaluate the in vitro chemopreventive potential of protease inhibitors from Enterolobium contortisiliquum seeds upon human colorectal adenocarcinoma cells. Two protease inhibitors were purified and named EcCI and EcTI. By means of N-terminal sequence analysis, EcCI was identified as a Kunitz type inhibitor. EcTI was identified, by means of peptide mass fingerprinting and N-terminal sequence analyses, as the same EcTI purified previously (NCBI Protein BLAST; access number: sp|P86451.1|ITRY_ENTCO). The molecular masses of the two inhibitors determined by means of SDS-PAGE and mass spectrometry are, respectively, 18.5 kDa and 19,710.4 Da (EcCI); 20.2 kDa and 19,813.22 Da (EcTI). Both inhibitors consist of two polypeptide chains and have several isoforms with acidic pIs, ranging from 5 to 6. Towards chymotrypsin, EcCI is a non competitive inhibitor and shows ki of 8 x 10-8 M, while EcTI is a competitive inhibitor with ki of 48 x 10-8 M. Towards trypsin, EcTI shows non competitive inhibition and ki of 2.8 x 10-8 M. EcCI and EcTI show high (93%) and moderate (38%) chymotrypsin inhibition and EcTI was also able to strongly inhibit trypsin (100%). EcCI and EcTI showed high leukocyte elastase inhibition (85 and 75%), respectively, and inhibited pancreatic elastase weakly (about 10%). Neither of them was able to inhibit papain nor bromelain. Both inhibitors are functionally stable under wide temperature range (from 37 to 70 °C – EcCI; from 37 to 60 °C – EcTI), pH (from 2 to 12) and DTT concentration (from 1 to 10 mM – EcCI; from 1 to 100 mM – EcTI). Both EcCI and EcTI were able to inhibit HT29 colorectal adenocarcinoma cells with IC50 of 35.5 and 20.4 x 10-6 M, respectively. These results clearly indicate that these are molecules with interesting biotechnological features and very promising tools as chemopreventive agents.
Descrição: BEZERRA, Lady Clarissa Brito da Rocha. Purificação, caracterização bioquímica e potencial quimiopreventivo de um novo inibidor de quimotripsina de sementes de Enterolobium contortisiliquum (Vell.) Morong. 2014. 110 f. Tese (Doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2014.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/19439
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