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Título: Estabilidade de genes de referência e expressão das proteínas Morfogenéticas Ósseas (BMPs), receptores de BMP e mensageiros intracelulares (SMADS) em folículos ovarianos caprinos
Título em inglês: Stability of housekeeping genes and levels of mRNA for Bone Morphogenetic Proteins (BMPs), BMP receptors and intracellular messengers (SMADs) in goat ovarian follicles
Autor(es): Costa, José Jackson do Nascimento
Orientador(es): Silva, José Roberto Viana
Palavras-chave: Caprinos
RNAm
Ovário
Folículos
Data do documento: 2011
Citação: COSTA, J. J. N. (2011)
Resumo: Este trabalho tem como objetivo avaliar a estabilidade de genes de referência e a expressão das proteínas morfogenéticas ósseas (BMP-2, 4, 6, 7 e 15), seus receptores (BMPR-IA, IB e II) e seus mensageiros intracelulares (SMADs-1, 5 e 8) em folículos caprinos antes e após cultivo por 18 dias. Para avaliar a estabilidade dos genes de referência e o nível de expressão das BMPs, receptores e SMADs, folículos com aproximadamente 0,2, 0,5 e 1 mm foram isolados mecanicamente de ovários caprinos. Além disso, folículos com aproximadamente 0,2 mm foram isolados e cultivados por 18 dias em meio de cultura suplementado com FSH. Após a extração do RNA total e síntese de cDNA, foi realizada a quantificação do RNAm, por PCR em tempo real, utilizando-se primers específicos para genes de referência (β-actina, PGK, GAPDH, β-tubulina, UBQ, RPL-19, rRNA18S), e para as BMPs (2, 4, 6, 7 e 15) receptores de BMPs (BMPR-IA, IB e II) e SMADs (1, 5 e 8). Os resultados mostraram que β-tubulina e PGK são os genes de referência mais estáveis em folículos frescos pré-antrais e antrais caprinos. Os RNAs mensageiros para as BMPs (2, 4, 6, 7 e 15), seus receptores (BMPR-IA, IB e II) e SMADs (1, 5 e 8) são expressos em diferentes níveis em folículos pré-antrais e antrais caprinos, sendo que a expressão do RNAm para BMP-4, BMP-6 e BMP-7 em folículos de 1 mm são significativamente maiores do que em folículos de 0,2 e 0,5 mm. Entretanto, os níveis de RNAm para BMP-2 foi reduzido em folículos de 1 mm, já os níveis de BMP-15 não diferiram entre as categorias foliculares analisadas. Os níveis de RNAm para BMPR-IB foram maiores em folículos de 0,2 mm do que em folículos de 0,5 e 1 mm, enquanto que o RNAm para BMPR-II foi significativamente maior em folículos de 0,5 mm do que em folículos de 0,2 e 1 mm. Por outro lado, níveis de RNAm para BMPR-1A não diferiram entre folículos analisados. Os níveis de RNAm para SMAD-5 foram significativamente maiores em folículos de 0,2 mm do que em folículos de 0,5 e 1 mm. Contudo, folículos de 0,5 mm mostraram níveis maiores de RNAm para SMAD-8 do que folículos de 0,2 e 1 mm. Os níveis de RNAm para SMAD-1 não diferiram entre os folículos. Após as comparações dentro de cada categoria folícular, BMP-15 foi mais expressa do que BMP-7 em folículos de 0,2 e 0,5 mm. Em folículos de 0,5 mm a expressão do BMPR-IB foi maior do que BMPR-II. Em todas as três categorias foliculares estudadas, a expressão da SMAD-5 foi superior a SMAD-8. Após o cultivo, os folículos apresentaram redução dos níveis de RNAm para BMP-2, BMP-4, BMP-7, BMPR-IA e SMAD-5. Em conclusão, β-tubulina e PGK são os dois genes housekeeping mais estáveis para folículos frescos caprinos com 0,2, 0,5 e 1 mm de diâmetro. BMPs, seus receptores e SMADs apresentam padrões de expressão específicos em cada categoria folicular estudada. No entanto, em folículos cultivados há uma variação na expressão dos componentes do sistema BMP, diferindo da expressão in vivo de folículos com o mesmo tamanho.
Abstract: The aims this study to evaluate the stability of reference genes and the expression of bone morphogenetic protein (BMP-2, 4, 6, 7 and 15), their receptors (BMPR-IA, IB and II) and intracellular messengers (SMADs- 1, 5 and 8) in goat follicles before and after culture for 18 days. To evaluate the stability of reference genes and the expression of BMPs, receptors and SMADs, follicles of approximately 0.2, 0.5 and 1 mm were mechanically isolated from goats ovaries. In addition, approximately 0.2 mm follicles were isolated and cultured for 18 days in culture medium supplemented with FSH. Both fresh and cultured follicles were subjected to total RNA extraction and synthesis of cDNA, the quantification of mRNA was carried out by real-time PCR using specific primers for genes of reference (GAPDH, β-tubulin, β-actin, PGK, UBQ, RPL - 19, rRNA18S) and BMPs (2, 4, 6, 7 and 15) receptors of BMPs (BMPR-IA, IB and II) and SMADs (1, 5 and 8). Results showed that β-tubulin and PGK are the most stable reference genes in goats preantral and antral follicles. The messengers RNA for BMP (2, 4, 6, 7 and 15), their receptors (BMPR-IA, IB and II) and Smads (1, 5 and 8) are expressed at different levels in preantral and antral goats, and mRNA expression for BMP-4, BMP-6 and BMP-7 in 1-mm follicles are significantly higher than in follicles of 0.2 and 0.5 mm. However, the levels of mRNA for BMP-2 were reduced in follicles 1 mm, as BMP-15 did not differ between follicular categories. The levels of mRNA for BMPR-IB were higher in follicles of 0.2 mm than in follicles of 0.5 and 1 mm, whereas the mRNA for BMPR-II was significantly higher in follicles than 0.5 mm in follicles of 0.2 to 1 mm. Moreover, mRNA levels for BMPR-1A did not differ between follicles examined. The levels of mRNA for SMAD-5 were significantly higher in 0.2 mm follicles than in follicles of 0.5 and 1 mm. However, follicles of 0.5 mm showed higher levels of mRNA for SMAD-8 than follicles 0.2 and 1 mm. The levels of mRNA for SMAD-1 did not differ between follicles. After the comparisons within each category follicle, BMP-15 expression was higher than BMP-7 in follicles between 0.2 and 0.5 mm. Follicles 0.5 mm in the expression of BMPR-IB was greater than BMPR-II. In all three follicular categories studied, the expression of SMAD-5 was superior to SMAD-8. After culture, follicles showed reduced levels of mRNA for BMP-2, BMP-4, BMP-7, BMPR-IA and SMAD-5. In conclusion, β-tubulin and PGK genes are the two most stable housekeeping for fresh goat follicles 0.2, 0.5 to 1 mm in diameter. BMPs, their receptors and SMADs have specific expression patterns in each category follicular studied. However, in cultured follicles showed a variation in the variation in the expression of BMP system components, differing from in vivo expression of follicles with the same size.
Descrição: COSTA, J. J. N. Estabilidade de genes de referência e expressão das proteínas Morfogenéticas Ósseas (BMPs), receptores de BMP e mensageiros intracelulares (SMADS) em folículos ovarianos caprinos. 2011. 122 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2011.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/20104
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