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Título: Purificação, caracterização bioquímica e atividade contra Candida spp. de uma nova proteína ligante à quitina de sementes de Moringa oleifera LAM.
Título em inglês: Purification, biochemical characterization and activity against Candida spp. of a new chitin binding protein from Moringa oleifera Lam seeds
Autor(es): Silva Neto, João Xavier da
Orientador(es): Vasconcelos, Ilka Maria
Palavras-chave: Prospecção
Moringa
Proteína vegetal
Antifúngica
Candidíase
Data do documento: 2015
Citação: SILVA NETO, J. X. (2015)
Resumo: Candida ssp. compreendem um grupo de leveduras que normalmente vivem na pele e mucosas do homem, podendo ocasionar candidíase, com consequências graves particularmente para indivíduos imunocomprometidos. Os principais antifúngicos utilizados no tratamento da candidíase são tóxicos e podem levar ao aparecimento de cepas resistentes. Uma alternativa promissora aos tratamentos convencionais é o uso de proteínas vegetais. Moringa oleifera é uma planta de grande valor nutricional e medicinal, com atividade antimicrobiana. Este trabalho objetivou purificar uma proteína ligante à quitina de sementes de M. oleifera e avaliar sua atividade antifúngica contra espécies de Candida. Mo-CBP2 (Mo: Moringa oleifera; CBP: “Chitin Binding Protein”) foi purificada a partir da fração albumina de sementes de M. oleifera por cromatografia de afinidade em matriz de quitina, seguida de cromatografia de troca catiônica. Mo-CBP2 representou em torno de 0,14% da proteína total da semente e se apresentou como uma única banda na eletroforese em condição nativa. Por espectrometria de massas, Mo-CBP2 é uma proteína de 13.160 Da. Em contraste, Mo-CBP2 emergiu em dois picos, com massas moleculares correspondentes a 33,0 e 66,0 kDa, após cromatografia de filtração em gel (pH 7,5). Mo-CBP2 apresentou-se como uma única banda proteica com massa molecular aparente de 25,0 kDa quando analisada por PAGE-SDS. Todavia, em Tricina-SDS-PAGE, Mo-CBP2, em condições não redutoras, resultou em duas bandas proteicas, uma na faixa de 13,0 kDa e outra superior a 17,0 kDa e, após tratamento com DTT e β-mercaptoetanol, mostrou bandas com massas moleculares aparentes de 7,0 e 4,0 kDa. Os dados em conjunto sugerem que Mo-CBP2 existe em diferentes formas oligoméricas. Mo-CBP2 é uma glicoproteína básica (pI 10,9) com 4,1% de carboidratos, não apresentando atividade hemaglutinante ou hemolítica frente a eritrócitos de coelho. A análise comparativa das sequências dos peptídeos trípticos obtidos a partir da Mo-CBP2 em solução, após LC-ESI-MS/MS, revelou similaridade com outras proteínas de M. oleifera, como a albuminas 2S denominada de Mo-CBP3. Mo-CBP2 foi capaz de inibir, in vitro, o crescimento de C. albicans, C. parapsilosis, C. krusei e C. tropicalis, com CIM variando de 9,45 a 37,9 µM. Em adição, Mo-CBP2 (18,9 µM) aumentou a permeabilidade da membrana celular e induziu a produção de espécies reativas de oxigênio em C. albicans, além de ter degradado o DNA do plasmídeo circular (pUC18) de Escherichia coli. Os resultados obtidos apontam para o potencial de uso da Mo-CBP2 como uma nova proteína antifúngica ativa contra Candida spp.
Abstract: Candida species encompass a group of yeast that normally lives on the skin and mucous surfaces of human beings, in which the infectious disease candidiasis can occur, with severe consequences particularly for immunocompromised patients. The available antifungal drugs used for the candidiasis treatment are usually toxic and can lead to the development of resistant strains. A promising alternative to the conventional treatments is the use of plant proteins. Moringa oleifera is a plant with valuable nutritional and medicinal properties, including antimicrobial activity. This work aimed to purify a chitin-binding protein from M. oleifera seeds and to evaluate its antifungal properties against Candida species. Mo-CBP2 (Mo: Moringa oleifera; CBP: Chitin Binding Protein) was purified from the albumin fraction of M. oleifera seeds through chitin affinity chromatography followed by cation exchange chromatography. Mo-CBP2 represented about 0.14% of the total seed protein and appeared as a single band on native PAGE. By mass spectrometry, Mo-CBP2 presented 13,160 Da. However, in contrast, after native gel filtration chromatography (pH 7.5) two protein peaks with molecular masses of 33.0 and 66.0 kDa emerged from Mo-CBP2. By SDS-PAGE, Mo-CBP2 migrated as a single band with an apparent molecular mass of 25.0 kDa. Nevertheless, Tricine-SDS-PAGE of Mo-CBP2 under non-reduced conditions revealed two protein bands in the range of 13.0 and 17.0 kDa. After DTT and β-mercaptoethanol treatments, Mo-CBP2 appeared as been composed of masses of 7.0 and 4.0 kDa. Altogether, these results suggest that Mo-CBP2 exists in different oligomeric forms. Moreover, Mo-CBP2 is a basic glycoprotein (pI 10.9) with 4.1% sugar, with did not display hemagglutinating or hemolytical activity upon rabbit erythrocytes. A comparative analysis of the sequence of triptic peptides from Mo-CBP2 in solution, after LC-ESI-MS/MS, revealed similarity with other M. oleifera proteins, as the 2S albumin Mo-CBP3. Mo-CBP2 possesses in vitro antifungal activity against Candida albicans, C. parapsilosis, C. krusei and C. tropicalis, with MIC ranging from 9.45 to 37.9 µM. In addition, Mo-CBP2 (18.9 µM) increased the cell membrane permeabilization and oxigen reactive species production in C. albicans and promoted degradation of circular plasmid DNA (pUC18) from Escherichia coli. The results presented in this work point out the potential of Mo-CBP2 as a new antifungal protein active against Candida spp
Descrição: SILVA NETO, João Xavier da. Purificação, caracterização bioquímica e atividade contra Candida spp. de uma nova proteína ligante à quitina de sementes de Moringa oleifera LAM. 2015. 107 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/21488
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