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Título: Purificacao e caracterizacao do pigmento vermelho R-Ficoeritrina da macroalga marinha Solieria filiformis (Kutzing) P.W. Gabrielson
Título em inglês: Purification and characterization of the red pigment R-Phycoerythrin from marine macroalga Solieria filiformis (Kützing) P.W. Gabrielson
Autor(es): Bastos Filho, Acrisio José Uchôa
Orientador(es): Benevides, Norma Maria Barros
Coorientador(es): Araújo, Márjory Lima Holanda
Palavras-chave: R-Ficoeritrina
Pigmento fluorescente
Corante natural
Solieria filiformis
Data do documento: 2016
Citação: BASTOS FILHO, A. J. U. (2016)
Resumo: A R-Ficoeritrina (R-FE), um pigmento fotossintético vermelho (ficobiliproteína) presente em macroalgas rodofíceas, tem ampla aplicação em biotecnologia como sonda fluorescente em imunologia, biologia celular, além de corante natural em alimentos e cosméticos. Diante disso, o presente trabalho teve por objetivo purificar e caracterizar parcialmente o pigmento fotossintético fluorescente R-FE da Solieria filiformis, macroalga marinha vermelha abundante no litoral nordestino brasileiro e com alto potencial para cultivo no mar. Um esquema de purificação com precipitação proteica (sulfato de amônio 90% de saturação), seguido por cromatografias em matrizes de DEAE-Sephacel e Sephacryl S-300, gerou um pigmento purificado apresentando três picos de absorção (495, 540 e 564 nm), um pico de emissão de fluorescência (575 nm, quando excitada a 495 nm), e um índice de pureza de 4,5, possibilitando sua aplicação como marcador fluorescente na biotecnologia. O processo de purificação da R-FE apresentou uma recuperação de 12,78% e um rendimento de 0,17 mg/g de alga seca. Por eletroforese (PAGE-SDS) a R-FE apresentou uma banda proteica na ausência do agente redutor e três bandas proteicas com massas moleculares de 18, 20 e 37 kDa, referentes as subunidades α, β e γ, na presença do agente redutor. A R-FE apresentou 60% de α-hélice em sua estrutura secundária, mantendo estabilidade dessa estrutura até 70 °C. As propriedades espectroscópicas da R-FE demonstraram estabilidade até 70 °C, porém, foi observada uma redução de 72,1 % e 98,5 % nos seus espectros de absorção e emissão de fluorescência, respectivamente, somente a 80 °C por 1 hora. A capacidade de absorção da R-FE pura, ao ser armazenada por 30 dias, se manteve estável nas temperaturas de -20 °C e 4 °C, porém, a 25 °C, foi observada uma redução significativa dos picos de absorção com 5 dias (81,6%, 90,6% e 92,7%, em relação aos picos de 495, 540 e 564, respectivamente). Quanto a sua capacidade de fluorescência, foi observada uma redução de 42,5 %, 33,3 % e 100 %, ao ser armazenada por apenas 5 dias nas temperaturas de -20 °C, 4 °C e 25 °C, respectivamente. Diante dos resultados, foi estabelecido um protocolo de purificação para R-ficoeritrina de S. filiformis, apresentando um elevado índice de pureza e uma alta massa molecular constituída de três subunidades monoméricas (α, β e γ), apresentando predominância de estrutura secundária em α-hélice termoestável, propriedades espectroscópicas (absorbância e fluorescência) de elevada estabilidade, e, sobretudo em condições adequadas de armazenamento.
Abstract: R-Phycoerythrin (R-PE) is a red photosynthetic pigment (phycobiliprotein) present in Rhodophyta and it has wide application in biotechnology as a fluorescent probe in immunology, cell biology, and natural colorant in foods and cosmetics. Therefore, this study aimed to purify and to characterize partially the fluorescent photosynthetic pigment R-PE from red marine macroalgae Solieria filiformis, abundant in the Brazilian northeastern coast with high potential for cultivation in the sea. A purification scheme with protein precipitation (ammonium sulfate 90% saturation) followed by chromatography on matrices DEAE-Sephacel and Sephacryl S-300, produced a purified pigment that have three absorption peaks (495, 540 and 564 nm), one fluorescence emission peak (575 nm when excited at 495 nm) and a purity index of 4.5, enabling it’s application as a fluorescent marker in biotechnology. The purification process of the R-PE was a recovery of 12.78% and a yield of 0.17 mg/g of dry seaweed. Electrophoresis (SDS-PAGE) of R-PE showed one protein band in the absence of reducing agent and three protein bands with molecular weight of 18, 20, 37 kDa, regarding the α, β and γ subunits, in the presence of a reducing agent. R-PE showed 60% of α-helix in their secondary structure, while maintaining stability of the structure up to 80 °C. The spectroscopic properties of the R-PE showed stability up to 70 °C, however, a reduction of 72.1% and 98.5% in their absorption and fluorescence emission spectra were observed, respectively, only at 80 °C for 1 hour . The absorption capacity of R-PE, stored for 30 days, remained stable at temperatures of -20 °C and 4 °C, but at 25 °C, a significant reduction of the absorption peak was observed at 5 days (81.6%, 90.6% and 92.7% compared to the peaks 495, 540 and 564, respectively). It was observed reduction of fluorescence capability of 42.5%, 33.3% and 100% when stored for 5 days at 20 °C, 4 °C and 25 °C, respectively. In accord with these results was established a purification protocol for R-phycoerythrin from S. filiformis, with a high purity index and a high molecular weight made up of monomeric subunits (α, β and γ), with predominance of secondary structure in α-helix thermostable, spectroscopic properties (absorption and fluorescence) of high stability, and especially in appropriate storage conditions.
Descrição: BASTOS FILHO, Acrisio José Uchôa. Purificacao e caracterizacao do pigmento vermelho R-Ficoeritrina da macroalga marinha Solieria filiformis (Kutzing) P.W. Gabrielson. 2016. 89 f. Dissertação (Mestre em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/21755
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