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Título: McLTP1 (Morinda citrifolia LIPID TRANSFER PROTEIN 1): efeito antimicrobiano in vitro e atividade protetora sobre a sepse induzida em camundongos
Autor(es): Souza, Adson Ávila de
Orientador(es): Oliveira, Hermógenes David de
Palavras-chave: Morinda citrifolia L.
Proteínas transferidoras de lipídeos
McLTP1
Propriedades antimicrobianas
Sepse
Data do documento: 2016
Citação: SOUZA, A. A. (2016)
Resumo: A resistência microbiana é um dos principais problemas de saúde pública deste século, e que tem levado ao aumento da preocupação dos quadros graves de sepse em unidades de tratamento intensivo. Diante da inespecificidade da terapia e inexistência de drogas aprovadas no tratamento da sepse, tem-se demandado novas abordagens terapêuticas. Dentre essas abordagens, peptídeos antimicrobianos vegetais têm se destacado como moléculas promissoras com possibilidade de intervenção terapêutica na saúde humana. Recentemente, nosso grupo de pesquisa isolou uma proteína transferidora de lipídeos do tipo 1 (McLTP1 - UniProt Accession Number: C0HJH5) das sementes de Morinda citrifolia L (noni). Este trabalho objetivou avaliar o potencial antibacteriano e antifúngico de McLTP1 sobre espécies de interesse clínico e investigar seu efeito protetor em camundongos submetidos à sepse. McLTP1 foi isolada através do fracionamento de proteínas do extrato total das sementes de noni com ácido tricloroacético 2,5% e ultrafiltração em membrana de 30 kDa. Propriedades antimicrobianas de McLTP1 foram avaliadas in vitro sobre crescimento planctônico e biofilmes de espécies de Candida spp. e de bactérias gram-positivas e gram-negativas em placas de 96 poços. Em adição, foi avaliado o efeito de McLTP1 sobre fatores de virulência bacterianos, e sua atividade moduladora sobre antimicrobianos da prática clínica. A sepse em camundongos foi induzida através do modelo de ligadura e perfuração do ceco, sendo avaliados a taxa de sobrevida, peso corpóreo e peso fresco relativo dos órgãos, parâmetros hematológicos e efeito antipirético em animais tratados por via intraperitoneal e oral com McLTP1 (8 mg/kg). Embora McLTP1 não tenha sido capaz de inibir a formação de biofilmes de Candida spp., a natureza antifúngica de McLTP1 foi observada por meio da inibição do crescimento planctônico de C. parapsilosis na concentração de 25 µg/mL (52,72%; p<0,05), e através da potencialização significativa do efeito de anfotericina B (0,06 μg/mL; 28,6% de inibição do crescimento de C. parapsilosis) quando no cotratamento com McLTP1 (50 μg/mL; 88,1% de inibição). Quanto à atividade antibacteriana, McLTP1 não inibiu o crescimento planctônico de bactérias gram-negativas, exibindo efeito contra bactérias gram-positivas do gênero Staphylococcus, sendo observadas inibições sobre células planctônicas variando entre 18,7% (0,78 μg/mL; p<0,05) e 98,8% (800 μg/mL; p<0,05), e sobre biofilmes em 34,5%, (12,5 μg/mL; p<0,05) a 73,6% (400 μg/mL). McLTP1 reduziu a atividade dos fatores de virulência bacterianos catalase e coagulase, e atuou em sinergismo com o antibiótico oxacilina. Em tratamentos profiláticos e terapêuticos na dose de 8 mg/kg pelas vias intraperitoneal e oral, McLTP1 aumentou a sobrevida de animais com sepse, apresentando efeito antipirético já nas primeiras horas após a indução da sepse. Além disso, McLTP1 reduziu significativamente o quadro de leucocitose observado nos animais com sepse do grupo controle. Portanto, McLTP1 possui propriedades antimicrobianas e efeito protetor sobre animais com sepse promissores, fato este inédito para essa classe de proteínas, configurando-se como candidato terapêutico potencial desta síndrome.
Abstract: Microbial resistance is a major public health problem of this century, that has led to increased concern of severe sepsis cases in intensive care units. Due to the nonspecific therapy and the absence of drugs approved for sepsis treatment, new therapeutic approaches has been demanded. Among these approaches, plant antimicrobial peptides have emerged as promising molecules with a potential therapeutic intervention in human health. Recently, our research group isolated a lipid transfer protein type 1 (McLTP1 - UniProt Accession Number: C0HJH5) from Morinda citrifolia L. seeds (noni). This study aimed to evaluate the antibacterial and antifungal potential of McLTP1 against species of clinical concern and investigate its protective effect in mice subjected to sepsis. McLTP1 was isolated from noni seeds crude extract by protein fractionation with trichloroacetic acid 2.5% and ultrafiltration in 30 kDa membrane. McLTP1 antimicrobial properties were evaluated in vitro against planktonic cells and biofilm of Candida spp., gram-positive and gram-negative bacteria species in 96-well plates. In addition, it was evaluated the effect of McLTP1 on bacterial virulence factors and its modulatory properties on clinical antimicrobial drugs. Sepsis in mice was induced by cecal ligation and puncture model, being evaluated the survival rate, body weight and fresh organ weights, haematological parameters and antipyretic effect in animals treated intraperitoneally and orally with McLTP1 (8 mg/kg). Although McLTP1 was not able to inhibit Candida spp. biofilm formation, McLTP1 antifungal activity was observed through growth inhibition of Candida parapsilosis planktonic cells at 25 μg/mL (52.72%; p < 0.05), and through the potentiation effect of amphotericin B (0.06 μg/mL; 28.6% inhibition C. parapsilosis growth) when in the cotreatment with McLTP1 (50 μg/mL; 88.1 % inhibition). Regarding to the antibacterial activity, McLTP1 did not inhibit gram-negative bacteria planktonic cells growth, exhibiting effect only against gram-positive bacteria of Staphylococcus genus, being observed inhibitions on planktonic cells ranging from 18.7% (0.78 μg/mL, p < 0.05) to 98.8% (800 μg/mL; p <0.05) and against biofilms from 34.5% (12.5 μg/mL; p < 0.05) to 73.6% (400 μg/mL). McLTP1 reduced the activity of bacterial virulence factors such as catalase and coagulase, and acted in synergism with the antibiotic oxacillin. In prophylactic and therapeutic treatments at a dose of 8 mg/kg by intraperitoneal and oral route, McLTP1 increased the survival of animals with sepsis, showing antipyretic effect within the first hours after sepsis induction. Moreover, McLTP1 significantly reduced leukocytosis condition observed to the animals of vehicle group with sepsis. In conclusion, McLTP1 showed promising antimicrobial properties and protective effects on animals with sepsis, a new activity for this class of proteins, configured as a therapeutic potential candidate to this syndrome.
Descrição: SOUZA, Adson Ávila de. McLTP1 (Morinda citrifolia LIPID TRANSFER PROTEIN 1): efeito antimicrobiano in vitro e atividade protetora sobre a sepse induzida em camundongos. 2016. 117 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/21817
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