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Título: Efeito anti-inflamatório e antinociceptivo de alcaloides imidazólicos de Pilocarpus microphyllus: estudo in vitro, in vivo e in silico
Título em inglês: Anti-inflammatory and antinociceptive effect of imidazole alkaloids of Pilocarpus microphyllus: in vitro, in vivo and in silico study
Autor(es): Rocha, Talita Magalhães
Orientador(es): Leal, Luzia Kalyne Almeida Moreira
Palavras-chave: Farmacologia
Jaborandi
Plantas Medicinais
Data do documento: 7-Fev-2017
Citação: ROCHA, T. M. ; Leal, L. K. A. M. (2017)
Resumo: As plantas medicinais têm se mostrado promissoras como fonte de novos fármacos para modular a resposta inflamatória, incluindo a dor inflamatória. Pilocarpus microphyllus, conhecida popularmente como jaborandi, é uma espécie nativa do Nordeste e amplamente explorada pela indústria farmoquímica para a extração da pilocarpina, um alcaloide imidazólico colinérgico. Suas folhas também possuem outros alcaloides, como epiisopilosina (EPIL) e epiisopiloturina (EPIT), obtidos de resíduo industrial. Estudos preliminares determinaram a ação anti-inflamatória e antinociceptiva da epiisopiloturina em camundongos. Diante do exposto, o objetivo do presente estudo foi investigar o potencial anti-inflamatório e antinociceptivo dos alcaloides EPIT e EPIL com determinação do possível mecanismo de ação. Para tanto, foram empregados modelos experimentais de inflamação em neutrófilos humanos, hiperalgesia mecânica induzida por carragenina em camundongos (Von Frey eletrônico) e estudo in silico. Na avaliação do potencial anti-inflamatório, foi observado que tanto EPIT quanto EPIL (1–100 μg/mL) inibiram a degranulação de neutrófilos (5x106 células/mL) determinada pela liberação de mieloperoxidase (MPO) induzida por PMA 0,1μM (CI40 = 14,3 e 29,5 μg/mL, respectivamente) ou fMLP 1μM (CI40 = 45,2 e 62,3 μg/mL, respectivamente). Esse efeito mostrou-se relacionado com a modulação do metabolismo oxidativo, no qual EPIT e EPIL inibiram em até 44 e 74%, respectivamente, a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) determinada por quimioluminescência – sonda luminol. Ademais foi observado que EPIT e EPIL também reduziram o influxo de Ca2+ na célula em 46 e 55%, respectivamente e inibiram a fosforilação do NF-κB citosólico, impedindo assim sua translocação para o núcleo. Destaca-se que as ações anti-inflamatória e antioxidante de EPIT e EPIL ocorreram sem afetar a viabilidade celular (teste do MTT e atividade da enzima lactato desidrogenase). No estudo da atividade antinociceptiva, EPIT e EPIL (0,3 e 1 mg/kg, i.p.) inibiram a hipernocicepção inflamatória induzida por carragenina (300 µg/pata) em camundongos e reduziram significativamente os níveis de MPO em até 87 e 74%, respectivamente, uma medida indireta da migração neutrofílica. O pré-tratamento dos camundongos com EPIT (1 mg/kg, i.p.) e EPIL (0,3 mg/kg, i.p.) reduziu a expressão de COX-2 em tecido subplantar induzida por carragenina em camundongos. EPIT e EPIL estabeleceram fortes interações com resíduos de aminoácidos considerados essenciais para a ligação com as isoformas COX-1 e COX-2. Os resultados obtidos sugerem que a atividade anti-inflamatória e antinociceptiva dos alcaloides imidazólicos, EPIT e EPIL, está relacionada, pelo menos em parte, a uma modulação na ativação e no acúmulo de células do sistema imune inato (neutrófilos) no foco inflamatório, possivelmente por redução do influxo de cálcio intracelular, ativação do NF-кB e expressão de COX-2.
Abstract: Medicinal plants have been shown to be promising as a source of alternative therapies to modulate the inflammatory response, including inflammatory pain. Pilocarpus microphyllus, popularly known as jaborandi, is a species native to the Northeast and widely exploited by the pharmochemical industry for the extraction of pilocarpine, a cholinergic imidazole alkaloid. Its leaves also have other alkaloids, such as epiisopilosine (EPIL) and epiisopiloturine (EPIT), obtained from industrial waste. Preliminary studies determined the anti-inflammatory and antinociceptive action of epiisopiloturine in mice. On the above, the aim of the present study was to investigate the anti-inflammatory and antinociceptive potential of the alkaloids EPIT and EPIL. For this, experimental models of inflammation in human neutrophils, mechanical hyperalgesia induced by carrageenan in mice (Von Frey electronic) and in silico study were used. In assessing the anti-inflammatory potential, both EPIT as EPIL (1 - 100 μg/mL) inhibited neutrophils degranulation (5 x 106 cells/mL) measured by myeloperoxidase activity in activated neutrophils by 1 μM fMLP (CI40 = 45.2 and 62.3 μg / mL, respectively) or 0.1 μM PMA (CI40 = 14.3 and 29.5 μg / mL, respectively). This effect was related to the modulation of the oxidative metabolism, in which EPIT and EPIL inhibited up to 44 and 74%, respectively, the production of reactive oxygen species (ROS) determined by chemiluminescence - luminol probe. In addition, it was observed that EPIT and EPIL also reduced the Ca2+ influx in the cell by 46 and 55%, respectively, and inhibited the phosphorylation of the cytosolic NF-κB, thus preventing its translocation to the nucleus. It is noteworthy that the anti-inflammatory and antioxidant actions of EPIT and EPIL occurred without affecting cel viability (MTT test and lactate dehydrogenase enzyme activity). In the study of antinociceptive activity, EPIT and EPIL (0.3 and 1 mg / kg, i.p.) inhibited carrageenan-induced inflammatory hypernociception (300 μg / paw) in mice and significantly reduced MPO levels by up to 87 and 74%, respectively, an indirect measure of neutrophil migration. Pretreatment of mice with EPIT (1 mg / kg, i.p.) and EPIL (0.3 mg / kg, i.p.) reduced the expression of COX-2 in subplantar carrageenan-induced tissue in mice. EPIT and EPIL were able to establish strong interactions with amino acid residues considered essential for binding to the COX-1 and COX-2 isoforms. The results obtained suggest that the anti-inflammatory and antinociceptive activity of imidazole alkaloids, EPIT and EPIL, are related, at least in part, to a modulation in the activation and accumulation of the innate immune system cells (neutrophils) in inflammatory focus, possibly by reducing intracellular calcium influx, activation of NF-кB and COX-2 expression.
Descrição: ROCHA, T. M. Efeito anti-inflamatório e antinociceptivo de alcaloides imidazólicos de Pilocarpus microphyllus: estudo in vitro, in vivo e in silico. 2017. 96 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Caerá, Fortaleza, 2017.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/22010
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