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Título: Adição de agentes antioxidantes na solução de vitrificação do tecido ovariano ovino: Uma perspectiva para refinar e aperfeiçoar o protocolo
Título em inglês: Addition of antioxidant agents in the vitrification solution of ovine ovarian tissue: A perspective to refine and improve protocol
Autor(es): Silva, Luciana Mascena
Orientador(es): Rodrigues , Ana Paula Ribeiro
Palavras-chave: Vitrificação
Antioxidantes
Mitocôndrias
Ovinos
Data do documento: 17-Fev-2017
Citação: SILVA, L. M. RODRIGUES, A. P. R.
Resumo: A vitrificação do tecido ovariano antes de tratamentos gonadotóxicos é uma alternativa para a preservação da reserva folicular, visando o reimplante futuro e consequentemente, a restauração da fertilidade feminina. No entanto, o processo de vitrificação causa alguns danos que precisam ser minimizados. Desta forma, o objetivo desse estudo foi verificar o efeito da catalase e o ácido alfa lipóico em diferentes concentrações para reduzir geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), visando obter menos danos sobre a morfologia e desenvolvimento folicular, densidade das células do estroma, alterações no DNA dos folículos pré-antrais ovinos, bem como atividade mitocondrial. Para isso, fragmentos de ovários ovinos foram distribuídos em 9 tratamentos: (1) fresco ou controle; (2) incubado por 24h - INC; (3) vitrificados sem antioxidantes (SAA) ou na presença de catalase (CAT) nas concentrações de (4) 10 - CAT10; (5) 20 - CAT20 ou (6) 40 - CAT40 UI/ml ou ainda na presença de ALA nas concentrações de (7) 25 - ALA25; (8) 50 - ALA50 ou (9) 100 ALA100 µM/ml. Após a vitrificação todos os fragmentos foram aquecidos e também incubados por 24 horas e foram avaliados quanto à morfologia e desenvolvimento folicular, bem como quanto aos níveis de ROS no meio de incubação. Posteriormente, apenas fragmentos dos grupos controle, INC, SAA, CAT40 e ALA100 foram analisados quanto à densidade das células do estroma, danos no DNA (teste TUNEL e fosforilação da H2AX), níveis de ROS e função mitocondrial dos folículos no tecido ovariano. Os dados foram submetidos ao pacote estatístico SAS, e de acordo com o comportamento dos mesmos os testes foram escolhidos e aplicados, sendo as diferenças consideradas estatisticamente significativas quando P<0,05. Ao contrário de outros tratamentos, a porcentagem de folículos morfologicamente normais no tecido ovariano vitrificado na presença de ALA em todas as concentrações, não diferiu do tecido fresco. A porcentagem de folículos em desenvolvimento foi maior em ALA 100 μM/mL do que aquelas encontradas no tecido incubado ou vitrificado com catalase (40 UI/mL) e ALA (25 ou 50 μM/mL). Entretanto, apesar do ALA na concentração de 100 µM/mL ter mantido a atividade mitocondrial, não foi suficiente para controlar a produção de ROS intracelular. O uso de catalase afetou significativamente os níveis de ROS (10 e 20 UI/mL), a densidade das células do estroma, bem como o dano do DNA revelado por γH2AX (40 IU/mL). A vitrificação de tecido ovariano ovino na presença de 100 µM/mL de ALA preservou a morfologia, promoveu o desenvolvimento e causou menos danos ao DNA dos folículos pré-antrais. Apesar dos resultados satisfatórios do presente estudo, é fundamental a realização de novos estudos para definir a concentração ideal de ALA, de modo a favorecer todos os parâmetros avaliados.
Abstract: Vitrification of ovarian tissue prior to gonadotoxic treatments is an alternative to preserve follicular reserve, with the aim of subsequent reimplantation and consequently, restoration of female fertility. However, the vitrification process causes some damage which should be minimize. Thus, Therefore, the objective of this study was to verify the catalase and alpha lipoic acid in different concentrations to reduce generation of reactive oxygen species (ROS), aiming to obtain less damage on follicular morphology and development, stromal cell density, alterations in the DNA, as well as mitochondrial activity of ovine preantral follicles. To achieved this objective, sheep ovarian fragments were distributed in 9 treatments: (1) fresh or control; (2) incubated for 24h (INC); (3) vitrified without antioxidants (SAA) or in the presence of catalase (CAT) at concentrations of (4) 10 - CAT10; (5) 20 - CAT20 or (6) 40 - CAT40 IU / ml or in the presence of ALA at concentrations of (7) 25 - ALA25; (8) 50-ALA50 or (9) 100 μM / ml (ALA100). After vitrification, all the fragments were warmed followed by incubation for 24 hours, finally, morphology and follicular development as well as ROS levels in the incubation medium were evaluated. Afterwards, the fragments of control, INC, SAA, CAT40 and ALA100 groups were analyzed for stromal cell density, DNA damage (TUNEL test and H2AX phosphorylation), ROS levels and mitochondrial function. The data were submitted to the statistical package SAS, and according to the behavior of the data and the differences were considered significant different when P <0.05. Unlike the other treatments, the percentage of morphologically normal follicles in the ALA groups with all the concentrations did not differ from the fresh tissue. Moreover, the percentage of developing follicles was higher in ALA100 than those found in the CAT40, ALA25 and ALA50 groups. However, whilst the treatment ALA100 maintained mitochondrial activity, it was not sufficient to control intracellular ROS production. In contrast, the treatments CAT10 and CAT20 significantly affected the ROS levels, stromal cell density as well as DNA damage revealed by γH2AX (CAT40). Additionally, the ovarian morphology was well preserved ALA100. It also promoted follicular development and caused less damage to the DNA of the preantral follicles. Despite the satisfactory results of the present study, it is fundamental to carry out new studies to define the ideal ALA concentration, in order to improve all the parameters evaluated.
Descrição: SILVA, L. M. Adição de agentes antioxidantes na solução de vitrificação do tecido ovariano ovino: Uma perspectiva para refinar e aperfeiçoar o protocolo. 2017. 122 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Morfofuncionais) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/22453
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