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Title in Portuguese: Estudo da atividade antifúngica e dos mecanismos de ação do peptídeo Ctn[15-34], um fragmento C-terminal da crotalicidina, derivado de uma catelicidina expressa nas glândulas de veneno de cascavéis
Title: Study of the antifungal activity and mechanisms of action of the Ctn peptide [15-34], a C-terminal fragment of crotalicidin, derived from a cathelicidin expressed in rattlesnake venom glands
Author: Targino, Carolina Sidrim de Paula Cavalcante
Advisor(s): Baptista, Gandhi Radis
Co-advisor(s): Falcão, Cláudio Borges
Keywords: Candida albicans
Necrose
Citometria de Fluxo
Issue Date: 27-Apr-2017
Citation: TARGINO, C. S. P. C. Estudo da atividade antifúngica e dos mecanismos de ação do peptídeo Ctn[15-34], um fragmento c- terminal da Crotalicidina, derivado de uma catelicidina expressa nas glândulas de veneno de cascavéis. 2017. 131 f. Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017.
Abstract in Portuguese: A crotalicidina (Ctn), uma catelicidina de 34-resíduos isolada de cascavel da América do Sul, e o seu fragmento (Ctn[15-34]) demonstraram previamente atividades antimicrobiana contra bactérias Gram negativas e citotóxica contra células tumorais. A extensão de tais efeitos tem sido relacionada com suas características físico-químicas, como a forma helicoidal e hidrofobicidade. O presente trabalho teve o objetivo geral de avaliar a atividade antifúngica do Ctn e seus fragmentos (Ctn[1-14] e Ctn[15-34]) e caracterizar os possíveis mecanismos de ação dos peptídeos contra Candida albicans. Determinação de Concentração inibitória mínima (CIM) e ensaios de viabilidade celular por ensaios de luminescência foram utilizados para avaliar a ação do Ctn e seus fragmentos (Ctn[1-14] e Ctn[15-34]) como agentes antifúngicos contra cepas clínicas de leveduras oportunistas e dermatófitos. A citotoxicidade em relação a células eucarióticas foi avaliada in vitro com células renais da linhagem HK-2 e eritrócitos. Ctn foi o peptídeo mais ativo contra dermatófitos e também o mais tóxico para células eucarióticas saudáveis. Os fragmentos Ctn[1-14] e Ctn [15-34] não demonstraram atividade contra dermatófitos, mas foram ativos contra leveduras patogênicas, incluindo várias espécies de Candida sp. e Cryptococcus laurentii, com CIMs de até 5μm. É interessante notar que os dois fragmentos peptídicos foram menos citotóxicos para as células HK-2 e menos hemolíticos para os eritrócitos humanos do que a Anfotericina B (ANF). A técnica checkerboard foi realizada para estimar os efeitos da combinação dos peptídeos com ANF frente a cepas de C. albicans. Foi observado o efeito sinérgico entre as crotalicidinas e a ANF, com a consequente redução nas CIM de ambos, fármaco e peptídeos. De modo geral, o fragmento Ctn[15-34] apresentou as menores CIMs contra as diferentes espécies de Candida, e baixa citotoxicidade contra células eucariotas. Para caracterizar a atividade anti-Candida do Ctn[15-34] foram realizados ensaios para determinar atividade fosfolipásica, a curva do tempo de morte, e técnicas de citometria de fluxo. O dano à membrana plasmática foi estimado com base na quantidade de produto gerada pela atividade fosfolipásica após tratamento do lípido 4N3OBA (substrato) com Ctn[15-34]; a 10 μM pode ser observado um grande aumento na atividade fosfolipásica em comparação com os lipídeos não tratados, e tratados com 5 μM. A análise das curvas de tempo de morte das células tratadas com Ctn[15-34] e AMB, mostrou que eles não reduziram o número de UFCs da mesma forma, sugerindo que Ctn[15-34] e AMB poderiam ter diferentes mecanismos de ação contra C .albicans. Ctn[15-34] promoveu rompimento da membrana celular, assim como outros peptídeos 10 antimicrobianos (PAMs), em leveduras. Além disso, a via de morte celular da C. albicans detectada por citometria após o tratamento com peptídeo foi a necrose, o que confirmou ainda mais a capacidade de dano da membrana celular por Ctn[15-34]. Juntos, Ctn e seus fragmentos são promissores para o tratamento de doenças fúngicas, e o Ctn[15-34] é um candidato muito valioso para o futuro desenvolvimento de um peptídeo antifúngico, que pode ser aplicado sozinho ou em combinação com um antibiótico padrão como a AMB
Abstract: Crotalicidin (Ctn), a 34-residue cathelicidin from a South American rattlesnake, and its fragment (Ctn[15–34]) have shown anti-infective and cytotoxic activities against Gramnegative bacteria and certain tumor lines, respectively. The extent of such effects has been related to physicochemical characteristics such as helicity and hydrophobicity. We now report the anti-fungal activity of Ctn and its fragments (Ctn[1–14]) and (Ctn[15–34]) And characterize the possible mechanisms of action of peptides against Candida albicans.MIC determination and luminescent cell viability assays were used to evaluate the anti-infective activity of Ctn and its fragments (Ctn[1–14]) and (Ctn[15–34]) as anti-fungal agents against opportunistic yeast and dermatophytes. Cytotoxicity towards healthy eukaryotic cells was assessed in vitro with healthy human kidney-2 (HK-2) cells and erythrocytes. Fragments Ctn[1–14] and Ctn[15–34] lost activity against dermatophytes, but became more active against pathogenic yeasts, including several Candida species and Cryptococcus laurentii, with MICs as low as 5 μM. Interestingly, the two peptide fragments were less cytotoxic to healthy HK-2 cells and less hemolytic to human erythrocytes than the standard-of-care amphotericin B (AMB).The checkerboard technique was performed to estimate the effects of combining either one of the peptides with AMB against C. albicans strains, and it was the synergy between Ctn peptides and AMB, with consequent reduction in MICs of both drug and peptides. In general, the Ctn[15-34] presented the smallest MICs against the different Candida species, and low cytotoxicity against eukaryotic cells. To characterize the anti- Candida activity of Ctn[15-34] were performed the phospholipase activity assay, time killing assay, and flow cytometry techniques.The plasmatic membrane damage was roughly estimated based on the amount of product generated by phospholipase activity after treatment of 4N3OBA lipid (substrate) with Ctn[15-34]; At 10 μM a big increase in phospholipase activity could be noticed compared to non-treated and treated lipids at 5μM. Analysis of the time killing assays of cells treated with Ctn [15-34] and AMB, showed that they did not reduce the number of CFUs in the same fashion, which suggested that Ctn[15-34] and AMB could have different mechanisms of action against C.albicans. Ctn[15-34] alone promoted cell membrane disruption, like other AMPs, in yeasts. Moreover, the C. albicans cell death pathway detected after the peptide treatment was necrosis, which further confirmed cell membrane damage capacity by Ctn[15-34].Together, Ctn and its fragments are promising for the treatment of fungal diseases, and the Ctn [15-34] is a most valuable candidate for further 12 development as an antifungal therapeutic peptide lead, particularly against yeast infections where it could be usedfully applied either alone or in combination with a standard antibiotic such as AMB.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/23217
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