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Title in Portuguese: Caracterização e atividade antibiofilme de polissacarídeos sulfatados extraídos da alga marinha verde Enteromorpha sp. cultivada em laboratório
Title: Characterization and antibiofilm activity of sulphated polysaccharides extracted from green seaweed Enteromorpha sp. cultivated in the laboratory
Author: Andrade, Francisco Regivânio Nascimento
Advisor(s): Sampaio, Alexandre Holanda
Co-advisor(s): Farias, Wladimir Ronald Lobo
Keywords: Alga
Cultivo
Carboidrato
Atividade biológica
Issue Date: 2017
Citation: ANDRADE, F. R. N. (2017)
Abstract in Portuguese: A colheita desenfreada de algas para extração de seus derivados causa um enorme problema ambiental, uma solução para diminuição desse impacto seria cultivá-las. Visto que as algas verdes se tornaram uma importante fonte de compostos bioativos, dentre eles os polissacarídeos sulfatados, objetivou-se cultivar a macroalga marinha verde Enteromorpha sp. em laboratório, a partir do isolamento de seus esporos obtidos na natureza, e dela extrair, purificar, caracterizar essas macromoléculas e avaliar seu efeito frente a formação de biofilme bacteriano. A alga foi cultivada em meio Guillard f/2 e os polissacarídeos sulfatados totais (PST) foram extraídos por digestão enzimática com papaína e fracionados em cromatografia de troca iônica DEAE-Celulose usando um gradiente salino do tipo “stepwise” com concentrações crescentes de NaCl (0,5 - 2,0 M). A fração majoritária mais metacromática foi produzida em coluna preparativa, isolada das demais, dialisada e liofilizada. Para melhor caracterização dos polissacarídeos extraídos, realizou-se uma análise por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) em uma coluna de troca iônica DEAE-Celulose, eluída por gradiente linear de NaCl (0 - 3,0 M). As frações de PST isoladas nas cromatografias, foram submetidos à eletroforese em gel de agarose e poliacrilamida. A determinação de açúcares totais, ácidos urônicos e sulfato foram pelos métodos fenol-ácido sulfúrico, carbazol-ácido sulfúrico e gelatina bário, respectivamente. A composição monossacarídica foi obtida por cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrometria de massa (CG-EM). Foram analisadas as atividades dos polissacarídeos sulfatados sobre o crescimento planctônico das bactérias Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa, bem como a sua ação sob a formação de biofilmes. A alga cresceu 4 cm de altura após 70 dias de cultivo. O rendimento de seu PST correspondeu a 10,8% de sua biomassa. No fracionamento do PST em cromatografia de troca iônica DEAE-Celulose, do tipo “stepwise”, foram obtidas cinco frações (0,7; 0,9; 1,2; 1,6 e 1,8 M) e a maior atividade metacromática evidenciada na fração F1,2M. Em sistema CLAE foram isoladas três frações a partir dos PST e um único pico a partir da fração F1,2M. A análise eletroforética revelou uma mobilidade bastante semelhante, bandas homogenias e alto peso molecular das amostras. O PST e as frações apresentaram quantidades significativas de açúcar total, variado teor de ácidos urônicos e alta sulfatação. O polissacarídeo apresentou em sua composição monômeros de ramnose (41,49%), xilose (17,35%), glicose (9,51%) e galactose (5,50%), 3-metil-ácido hexaurônico (6,91%) e 3-metil-hexose (2,81%). No ensaio bacteriano, observou-se uma diminuição significativa do crescimento planctônico e em relação a formação do biofilme os resultados mostraram redução estatisticamente significativa para todas as concentrações de polissacarídeos testadas, em ambas as bactérias. É possível cultivar a macroalga marinha verde Enteromorpha sp., em laboratório a partir de seus esporos e utilizando métodos colorimétricos, turbidimétricos, eletroforéticos e cromatográficos, aliado a espectrometria de massa é possível fracionar, purificar e analisar quimicamente sua estrutura, nesse trabalho concluiu-se também que essas moléculas são eficientes em diminuir a formação de biofilmes bacterianos.
Abstract: Rampant harvesting of algae for extraction of its by products causes a huge environmental problem, one solution to lessening that impact would be to grow it. As green algae became an important source of bioactive compounds, among them the sulfated polysaccharides, the objective was to cultivate the green marine macroalgae Enteromorpha sp. in the laboratory, from the isolation of their spores obtained in nature, and extract, purify, characterize these macromolecules and evaluate their effect against bacterial biofilm formation. The algae were grown in Guillard f / 2 medium and the total sulfated polysaccharides (PST) were extracted by enzymatic digestion with papain and fractionated by ion exchange chromatography DEAE- Cellulose using a stepwise salt gradient with increasing concentrations NaCl (0.5 - 2.0 M). The most metachromatic major fraction was produced in a preparative column, isolated from the others, dialysed and lyophilized. For a better characterization of the extracted polysaccharides, a high efficiency chromatography (HPLC) analysis was performed on a DEAE-Cellulose ion exchange column, eluted by linear NaCl gradient (0 - 3.0M). The PST fractions isolated in the chromatograms were submitted to agarose and polyacrylamide gel electrophoresis. The determination of total sugars, uronic acids and sulfate were by phenol-sulfuric acid, carbazole-sulfuric acid and barium gelatine, respectively. The monosaccharide composition was obtained by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS). The activities of the sulfated polysaccharides on the planktonic growth of bacteria Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa, as well as their action under the formation of biofilms, were analyzed. The algae grew 4 cm high after 70 days of cultivation. The yield of its PST corresponded to 10.8% of its biomass. In the fractionation of PST in DEAE-Cellulose ion exchange chromatography, stepwise, five fractions were obtained (0.7,0.9, 1.2, 1.6, 1.8 M) and the highest metachromatic activity evidenced in the F1.2 M fraction. In the HPLC system, three fractions were isolated from the PST and a single peak from the F1.2 M fraction. The electrophoretic analysis showed a similar mobility, homogenous bands and high molecular weight of samples. The PST and the fractions presented significant amounts of total sugar, varied uronic acid content and high sulfation. The polysaccharide presented monomers of rhamnose (41.49%), xylose (17.35%), glucose (9.51%) and galactose (5.50%), 3-methyl hexauronic acid (6.91%) and 3-methyl hexose (2.81%). In the bacterial assay, a significant decrease in planktonic growth was observed and in relation to biofilm formation the results showed a statistically significant reduction for all concentrations of polysaccharides tested in both bacteria. It is possible to cultivate the green marine macroalgae Enteromorpha sp., in the laboratory from its spores and using colorimetric, turbidimetric, electrophoretic and chromatographic methods, together with mass spectrometry it is possible to fractionate, purify and chemically analyze its structure, in this work it was also concluded. That these molecules are efficient in decreasing the formation of bacterial biofilms.
Description: ANDRADE, Francisco Regivânio Nascimento. Caracterização e atividade antibiofilme de polissacarídeos sulfatados extraídos da alga marinha verde Enteromorpha sp. cultivada em laboratório. 2017. 72 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia de Recursos Naturais)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/27814
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