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Title in Portuguese: Efeito esofagoprotetor de um biopolímero, a goma do cajueiro, na doença do refluxo não-erosiva em murinos e em biópsias esofágicas humanas: perfil anti-inflamatório e efeito tópico
Title: Esophagoprotective effect of a biopolymer, cashew gum, in murine non-erosive reflux disease and in human esophageal mucosa: antiinflammatory profile and topical effect
Author: Nicolau, Lucas Antônio Duarte
Advisor(s): Souza, Marcellus Henrique Loiola Ponte de
Keywords: Anacardium occidentale
Neopreno
Inflamação
Refluxo Gastroesofágico
Issue Date: 12-Jan-2018
Citation: NICOLAU, L. A. D. Efeito esofagoprotetor de um biopolímero, a goma do cajueiro, na doença do refluxo não-erosiva em murinos e em biópsias esofágicas humanas: perfil anti-inflamatório e efeito tópico. 2018. 117 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2018.
Abstract in Portuguese: A Doença do Refluxo Gastroesofágico (DRGE) pode ser definida como sintomas ou danos na mucosa produzidos pelo refluxo anormal do conteúdo gástrico no esôfago. Formas alternativas de tratamento devem ser consideradas uma vez que o tratamento padrão falha em todos os fenótipos da doença, majoritariamente em pacientes com o fenótipo mais prevalente (Doença do Refluxo Não-Erosiva, NERD). Nosso objetivo foi avaliar o efeito protetor da mucosa esofágica pelo biopolímero da Goma do Cajueiro (GC), um produto natural obtido da casca da árvore do Nordeste brasileiro (Anacardium occidentale L.), em camundongos (modelo experimental de NERD) e em biópsias do esôfago humano. O projeto experimental foi dividido em "Estudo Pré-Clínico: NERD murino" e em "Estudo Clínico: Biópsias esofágicas humanas". A princípio, os camundongos foram submetidos a uma indução cirúrgica da NERD, na qual realizou-se uma sub-estenose pilórica seguida de ligadura de fundo gástrico. Após 7 dias, os animais foram eutanasiados e amostras de esôfago distal retiradas para avaliar indícios sugestivos de inflamação, tais como edema, atividade da MPO e infiltrado de neutrófilos [escores histológicos e citocina inflamatória (KC)]. No estudo da função de barreira, amostras de esôfago distal de camundongos foram montadas em câmaras Üssing para avaliar a Resistência Elétrica Transepitelial (RETE) e, em seguida, a permeabilidade à fluoresceína. Em biópsias esofágicas humanas, também foi avaliado RETE e permeabilidade transepitelial. Além disso, um teste de toxicidade aguda foi conduzido de acordo com a diretriz 423 da OCDE. Por fim, realizamos um experimento utilizando técnicas de microscopia confocal para localizar no epitélio esofágico o biopolímero GC previamente marcado com FITC. Em nosso estudo, os animais com NERD estabeleceram edema esofágico (peso úmido aumentado como indicador indireto de edema e arquitetura histológica alterada como marcador direto de edema) e aumento da atividade de MPO (15,90 ± 1,68 mg/cm e 23,14 ± 9,3 U/mg de tecido, respectivamente), enquanto a administração diária de GC reduziu (P<0,05) parâmetros inflamatórios de edema e infiltração de neutrófilos (10,52 ± 0,5 mg/cm e 6,11 ± 0,57 U/mg de tecido, respectivamente). Os camundongos com NERD tiveram os níveis de KC aumentados (40,82 ± 11,71 pg/mg de tecido) no tecido esofágico, enquanto esse fenômeno foi reduzido (P<0,05) pela administração de GC (4,46 ± 1,3 pg/mg de tecido). Os parâmetros microscópicos (neutrófilos intraepiteliais e edema na lâmina própria diminuídos) e níveis reduzidos de KC corroboram o perfil anti-inflamatório da GC. Os parâmetros funcionais de barreira estudados demonstraram que a GC protegeu a mucosa esofágica. Enquanto os animais do NERD apresentaram uma queda substancial na RETE (-40 ± 3,5%) e uma permeabilidade da mucosa esofágica aumentada (13,9 ± 1,51 IF), GC 10% reverteu parcialmente (P<0,05) esses marcadores funcionais (+0,3 ± 0,82% e 3,99 ± 1,13 IF, respectivamente). Vale ressaltar que a GC não induziu sinais de toxicidade que conferem ao biopolímero GC segurança e boa tolerabilidade de acordo com a diretriz 423 da OCDE. Além disso, nossos dados em biópsias humanas mostraram que 30 minutos de exposição ácida à mucosa esofágica causou queda da RETE (-27,3 ± 2,4 %) em comparação com os níveis da resistência basal, que pôde ser prevenida (P<0,05) pela aplicação do alginato (+3,7 ± 6,1% em relação à resistência basal). Da mesma forma, o revestimento tecidual com GC (10% e 5%) impediu a queda da RETE (P<0,05) quando comparada com a resistência basal (+1,69 ± 1,06% e -3,5 ± 2,4%, respectivamente). GC em 2,5% e sucralfato não protegeram a mucosa esofágica contra a solução desafio que mimetiza o conteúdo de suco gástrico. O efeito protetor da mucosa foi sustentado até 1h, em que as biópsias não submetidas a nenhuma proteção apresentaram queda de -36,79 ± 5,5% na RETE, mas a aplicação de alginato e GC 10% impediu a queda de resistência causada por acidificação, pepsina e TDCA (+4,2 ± 0,8% e +3,5 ± 0,6%, respectivamente). A permeabilidade à fluoresceína aumentou em biópsias sem proteção prévia (135,7 ± 37,43 IF), enquanto que a GC 10% impediu (P<0,05) este evento (40,8 ± 17,1 IF). As imagens do microscópio epifluorescente mostraram a aderência luminal à mucosa esofágica exercida pela GC 10% marcado com FITC até 1h. Até o presente momento, não existe um medicamento que atue tanto na mucosa esofágica evitando o ataque ácido quanto na resolução no sítio da inflamação esofágica. Tanto no NERD experimental murino quanto em biópsias da mucosa esofágica humana, a GC mostrou 1) potencial anti-inflamatório ao esôfago, reduzindo marcadores da inflamação esofágica, 2) tópica proteção contra um ácido "agressivo", pepsina, solução BA, 3) aderência in vitro à mucosa esofágica humana por pelo menos 1 hora, e 4) ausência de sinais tóxicos, ou seja, bem tolerável em camundongos. Portanto, é a primeira vez que um produto exibe não apenas uma proteção tópica à mucosa esofágica, mas também a vantagem do perfil anti-inflamatório que pode ser útil no manejo da DRGE. Esses benefícios devem ser explorados ainda mais para o desenvolvimento de uma nova abordagem tópica e anti-inflamatória como terapia complementar para DRGE.
Abstract: Gastroesophageal reflux disease (GERD) can be defined as symptoms or mucosal damage produced by the abnormal reflux of gastric contents into the esophagus. Alternative ways of treatment must be considered since the standard therapy fails in all phenotypes of GERD, expressly in the most prevalent form (Non-Erosive Reflux Disease, NERD). We aimed to assess the esophageal mucosal protection effect of the biopolymer cashew gum (CG), a natural product obtained from bark of Brazilian northeastern tree (Anacardium occidentale L.), in mice (experimental model of NERD, non-erosive reflux disease) and in human esophageal biopsies. Experimental design was divided in “Pré-Clinical Studies: Murine NERD” and in “Human Oesophageal Biopsies Studies”. Firstly, mice were achieved by a surgical induction of NERD in which a pyloric sub-stenosis and ligation of forestomach were performed. After 7 days, animals were euthanized and samples of distal oesophagus taken to assess suggestive hallmarks of inflammation such as oedema, MPO activity and neutrophil infiltrate [histologic scores and keratinocyte-derived cytokine (KC)]. In functional studies, distal oesophageal samples of mice were mounted in Üssing chambers to evaluate Transepithelial Electrical Resistance (TER) and permeability to fluorescein. In human esophageal biopsies, it was evaluated TER and permeabiliy, but with pH adjustment to 2. As control in biopsies studies, alginate was used, besides sucralfate also was evaluated. In addition, an acute toxicity test was conducted in accordance with OECD guideline 423. Finally, we performed an epifluorescence microscopy to localize on the oesopageal epithelium the biopolymer previously labeled with FITC. In our study, animals with NERD established oesophageal oedema (augmented wet weight as an indirect oedema hallmark and altered histologic architecture as a direct oedema hallmark) and increased MPO activity (15.90±1.68 mg/cm and 23.14±9.3 U/mg tissue, respectively), while CG daily administration reduced (P<0.05) inflammatory parameters of oedema and neutrophil infiltration (10.52±0.5 mg/cm and 6.11±0.57 U/mg tissue, respectively). Mice with NERD had increased KC levels (40.82±11.71 pg/mg of tissue) in the oesophageal tissue while this phenomenon was (P<0.05) reduced by CG administration (4.46±1.3 pg/mg of tissue). The microscopic parameters (reduced intraepithelial neutrophils and oedema in the lamina propria) and reduced KC levels corroborate the anti-inflammatory profile of CG. Functional parameters studied demonstrated that CG protected the oesophageal mucosa. While NERD animals had a substantial drop in TER (-40±3.5%) and an augmented oesophageal mucosal permeability (13.9±1.51 RFI), CG 10% reverted partially (P<0.05) these functional markers (+0.3±0.82% and 3.99±1.13 RFI, respectively). It is worth mentioning that the CG did not induce any toxicity signs which ensured a safety biopolymer according to OECD guideline 423. Furthermore, our data in human biopsies showed that 30 minutes of mucosal exposure to the acidic solution caused TER drop (-27.3±2.4%) compared with 100% of basal resistance, that could be prevented (P<0.05) by alginate pre-coating (+3.7±6.1% over basal resistance). Similarly, pre-coating with CG solutions (10% and 5%) prevented the TER drop (P<0.05) when compared with basal resistance (+1.69±1.06% and -3.5±2.4%, respectively). CG at 2.5% and sucralfate did not protect the oesophageal mucosa against the challenge solution that mimics the gastric juice content. The mucosal protective effect was extended up to 1h in which unprotected biopsies had shown a drop of -36.79±5.5%, but alginate and CG 10% pre-coating prevented the resistance drop caused by acidification, pepsin and BA (+4.2±0.8% and +3.5±0.6%, respectively). The permeability to fluorescein increased in unprotected biopsies (135.7±37.43 RFI), whereas CG 10% prevented (P<0.05) this event (40.8±17.1 RFI). Epifluorescent microscope images showed mucosal luminal adherence of FITC-labeled CG 10% for up to 1h. Up to now, there is no therapeutic tools which could display in the same time a role of pre-epithelial barrier and anti-inflammatory framework to oesophageal mucosa injured by gastric contents such as CG did. Both in murine experimental NERD and in human oesophageal mucosal biopsies CG showed 1) anti-inflammatory potential to oesophagus by reducing key hallmarks of oesophageal inflammation in reflux oesophagitis, 2) topical protection against an “aggressive” acid, pepsin, BA solution, 3) in vitro adherence to human mucosa for at least 1 hour, and 4) nontoxic signs, i.e., well tolerable by mice. Then, it is the first time that a product displays not only a topical protection to oesophageal mucosa, but also an anti-inflammatory profile advantage that may be useful in GERD management. These benefits should be further explored in development of new topical and anti-inflammatory approach as add-on therapy for GERD.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/29302
metadata.dc.type: Tese
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