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Title in Portuguese: Estudo da via PI3k/AKT e da perda de Heterozigosidade do gene supressor tumoral Pten em lesões potencialmente malignas e Carcinoma epidermoide oral
Title: Study of the PI3K / AKT pathway and the loss of heterozygosity of the tumor suppressor gene Pten in potentially malignant lesions and oral squamous cell carcinoma
Author: Chaves, Filipe Nobre
Advisor(s): Pereira, Karuza Maria Alves
Keywords: Carcinoma de Células Escamosas
Fosfatidilinositol 3-Quinase
Perda de Heterozigosidade
Imuno-Histoquímica
PTEN Fosfo-Hidrolase
Issue Date: 17-Nov-2017
Citation: CHAVES, F. N. Estudo da via PI3K/AKT e da perda de Heterozigosidade do gene supressor tumoral Pten em lesões potencialmente malignas e Carcinoma epidermoide oral. 2017. 146 F. Tese (Doutorado em Odontologia) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017.
Abstract in Portuguese: As desordens potencialmente malignas (DPM) orais, constituem um grupo de lesões que apresentam risco para o desenvolvimento de carcinomas epidemóides orais (CEO), destacando entre estas a Displasia Epitelial Oral (DEO). Tem sido descrito que a via PI3K / AKT é uma das vias que está desregulada nos cânceres, apresentando o PTEN como um gene supressor para essa via. Entretanto ainda pouco se conhece como essa via está envolvida no processo de transformação maligna nas DPM. Perda de heterozigosidade (LOH) tem sido evidenciado como um preditor de transformação maligna em DEO e em carcinomas de diversas localizações. Além disso, sugere-se que a perda alélica do PTEN também ocorra em estágios iniciais de lesões malignas e esteja envolvida nos mecanismos da carcinogênese oral. Assim, compreender melhor o papel dessa via no processo de carcinogênese oral é de suma importância, buscando identificar possíveis marcadores moleculares para o câncer oral. Objetivo: Avaliar a via PI3K/AKT no processo de malignização em DPM de diferentes estágios e em CEOs, através da imunoexpressão de pAKT, pJNK, FoxO3a e Ki-67, além de realizar avaliação imunomolecular do gene supressor tumoral PTEN em amostras de DEO e CEO, com diferentes tipos histológicos de malignidade, por meio da análise de LOH em duas regiões cromossômicas e avaliação imunoistoquímica da proteína PTEN. Materiais e Métodos: Para a análise imunoistoquímica da via PI3K/AKT, foi realizado um estudo qualitativo e quantitativo, em diferentes localizações celulares, de 20 casos de DEO, 20 casos de CEO e 5 casos de mucosa oral normal, submetidos a reação imunoistoquímica para os anticorpos anti-pAKT, anti-pJNK, anti-FoxO3a e anti-Ki-67. Para a análise molecular, na amostra constituída de 19 DEO e 16 CEO foi realizada a análise de LOH por meio de marcadores de região microssatélites do PTEN, D10S1765 e AFMA086WG9, localizados nas regiões cromossômicas 10q23.3 e 10q23.31 respectivamente. Também foi realizada a avaliação imunoistoquímica da proteína PTEN para avaliar se a LOH deste gene está envolvida na expressão proteica em DEO e em diferentes estágios histológicos de CEO. Resultados: Na análise imunoistoquímica da via PI3K/AKT, foi observado uma maior imunomarcação de p- AKT nuclear em pacientes com CEO (21,2 ± 19,0) quando comparado a DEO (7,9 ± 8,1) e controle (1,8 ± 4,7) (p = 0,002). Uma maior imunomarcação forte nuclear de p-JNK foi encontrada nos controles (48,3 ± 13,7) quando comparada a DEOs (11,0 ± 10,3) e CEOs (1,1 ± 1,3) (p <0,001). Imunomarcação nuclear forte de FoxO3a estava ausente nos CEOs estudados (0,0 ± 0,1) com pouca marcação em DEOs (3,2 ± 5,4) e expressão aumentada em controles (13,5 ± 4,8) (p <0,001). A média das células positivas para Ki-67 foi diretamente associada ao grau de diferenciação celular (p <0,001). Na análise molecular de LOH, foi demonstrado que para o marcador AFMA086WG9 foi evidenciada retenção alélica em 89,5% dos casos de DEOs e em 100% de CEOs, na análise do marcador D10S1765 foi demonstrada LOH em 57,2% de DEOs e 50% de CEOs. Na avaliação imunoistoquímica de PTEN, foi detectada imunomarcação nuclear e citoplasmática, com maior imunomarcação nuclear em células de CEOs, em comparação com DEOs e grupo controle (p <0,001), além de um forte imunomarcação citoplasmática nos casos de CEOs do que em DEOs (p <0,045). Conclusões: A via PI3K / AKT parece estar envolvida no processo de malignidade de DEOs, especialmente p-JNK e FoxO3a com atividade antitumoral em OED e OSCCs analisados. Nós fornecemos provas de que a perda alélica de PTEN está presente em lesões orais pré-malignas e OSCCs, no entanto, a LOH neste gene não influenciou a sua expressão protéica nos casos avaliados. Além disso, a imunoexpressão PTEN em DEO e CEO também foi evidenciada, sendo independente de seu estadiamento histopatológico, provando que a PTEN não parece influenciar a tumorigênese dos CEOs.
Abstract: Oral Potentially Malignant Lesions (PML) is a group of lesions that present a risk for the development of Oral Squamous Cell Carcinoma (OSSC), including Oral Epithelial Dysplasia (OED). PTEN is a tumor suppressor gene of the PI3K / AKT pathway, which is one of the more deregulated pathways of cancer. However, it is still unknown how this pathway is involved in the malignant transformation process of PML. The heterozygosity loss (LOH) profiles were validated as predictors of malignant transformation of OED and in carcinomas from several locations. In addition, it is not known whether the allelic loss of PTEN also occurs in malignant lesions in the early stage and, as well, is involved as one of the mechanisms of oral carcinogenesis. In addition, it is suggested that allelic loss of PTEN also occurs in the early stages of malignant lesions and is involved in the mechanisms of oral carcinogenesis. Thus, a better understanding of the role of pathway in the process of oral carcinogenesis is necessary, searching for possible molecular markers for oral cancer. Objective: To evaluate the PI3K/AKT pathway in the malignant transformation process of PML and CEOs, through the immunoexpression of pAKT, pJNK, FoxO3a and Ki-67, besides performing immunomolecular evaluation of the PTEN tumor suppressor gene in DEO and CEO samples, with different histological types of malignancy, through the analysis of LOH in two chromosomal regions and immunohistochemical evaluation of the PTEN protein. Materials and methods: Tissue samples of 20 cases of OSCCs, 20 OEDs and 5 cases of normal oral mucosa were subjected to immunohistochemistry reactions for anti-p-AKT, anti-p-JNK, anti-FoxO3a and anti-Ki-67 antibodies. It was analyzed quantitative (number of immunostained cells) and qualitative (immunostaining intensity) parameters in different cell immunostaining sublocations. For molecular analysis, formalin-fixed paraffin-embedded samples of 19 OED and 16 OSCC were included to immunohistochemistry and LOH analysis. For the immunohistochemical study, 5 random fields with greater immunoreactivity were photomicrographed and it was done the count of keratinocytes which showed cytoplasmic and nuclear staining. For LOH analysis, 2 polymorphic microsatellite markers (AFMA086WG9 and D10S1765) localizing to chromosomes 10 were used to detect LOH. Results: Nuclear p-AKT was observed significantly greater immunostaining in CCEOs (21.2 ± 19.0) than in dysplasias (7.9 ± 8.1) and control (1.8 ± 4.7) (p = 0.002). Immunostaining of strong nuclear p-JNK was greater in controls (48.3 ± 13.7) than in OEDs (11.0 ± 10.3) and OSCCs (1.1 ± 1.3) (p<0.001). Strong nuclear immunostaining of FoxO3a proved to be absent in OSCCs (0.0 ± 0.1) with little staining on dysplasia (3.2 ± 5.4) and increased expression in controls (13.5 ± 4.8) (p<0.001). The mean Ki- 67 positive cells were directly associated with the degree of cell differentiation (p <0.001). Molecular analysis of LOH, it was demonstrated that for marker AFMA086WG9 allelic retention in 89.5% of OEDs cells and in 100% of OSCC cells, in the analysis of marker D10S1765 LOH was demonstrated in 57.2% of OEDs and 50 % of OSCCs. Higher nuclear immunostaining was detected in cases of OSCCs when compared to OEDs and control group (p <0.001) and strong cytoplasmic immunostaining was more present in OSCCs (p <0.045). Conclusion: The PI3K / AKT pathway appears to be involved in the process of malignancy of DEOs in this research, especially p-JNK and FoxO3a with antitumor activity in both OED and OSCCs analyzed. We provide evidence that the allelic loss of PTEN is present in premalignant oral lesions e OSCCs, however the LOH in this gene did not influence its protein expression in the evaluated cases. In addition, the PTEN immunoexpression in DEO and CEO was also evidenced, being independent of its histopathological staging, proving that PTEN does not seem to influence the tumorigenesis of CEOs.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/29714
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