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Title in Portuguese: Estudo in vivo e in vitro da infecção viral por IMNV e desenvolvimento de um sistema de ensaio em hemócitos de camarão marinho Litopenaeus vannamei visando a prospecção de agentes antivirais.
Title: In vivo and in vitro study of the viral infection by IMNV and development of an assay system in primary hemocytes culture of marine shrimp Litopenaeus vannamei for the prospection of antiviral agents.
Author: Vieira, Patrícia Raquel Nogueira
Advisor(s): Baptista, Gandhi Rádis
Keywords: Litopenaeus vannamei
IMNV
Replicação viral
Diagnóstico molecular
Peptídeo antiviral
Eicosapeptídeo derivado de catelicidina
Ensaio de viabilidade celular/citotoxicidade por fluorescência
Cultura primária de hemócitos
Issue Date: 2017
Citation: VIEIRA, P. R. N. (2017)
Abstract in Portuguese: O cultivo de camarão é uma atividade econômica importante em países tropicais como o Brasil. Contudo, a atividade tem enfrentado recorrentes surtos de epizootias, causando grandes perdas para o setor. Os problemas têm sido provocados principalmente pela disseminação de vírus. O vírus da mionecrose infecciosa (IMNV) é um destes agentes epizoóticos que afetam a produção de camarão no Brasil. Na principal região brasileira de produção de camarão, sabe-se que uma redução nos índices de salinidade dos viveiros de cultura causa o aparecimento de doenças virais, ou seja, quando coincide com o início da estação chuvosa de cada ano. Porém, não há no mercado fármacos disponíveis para tratar ou prevenir os surtos recorrentes de viroses em fazendas. Diante disso, o objetivo dessa tese foi estudar a replicação do IMNV in vivo e in vitro e testar a potencial atividade antiviral do Ctn[15-34]. Para isso, foi realizado um estudo da replicação do IMNV em níveis controlados de salinidade durante as primeiras 12 horas de infecção in vivo, bem como, o desenvolvimento de um sistema de ensaio in vitro, utilizando hémocitos de Litopenaeus vannamei em cultivo, com o objetivo de obter a concentração inibitória (CI50) do vírus nessas células, aliado a busca de substâncias antivirais. Utilizando PCR quantitativa em tempo real e análise estatística, verificamos que a baixa salinidade facilita a replicação e proliferação de IMNV in vivo, diminuindo o tempo de geração de 57,4 min (a 35 g L-1, salinidade ideal) para 25,2 min a (5 g L-1, concentração estressante). Da mesma forma, foi demonstrada uma correlação positiva entre a diminuição da salinidade e a redução do tempo de geração de outro vírus – necrose infecciosa hipodérmica e hematopoética (IHHNV). O IHHNV apresenta uma alta taxa de prevalência e normalmente coinfecta camarões em viveiros de cultivo, onde o IMNV surge como surtos. Com relação à replicação in vitro, ensaios de citotoxicidade, baseado em fluorescência, em combinação com PCR quantitativa, demonstrou, nesse trabalho, que a CI50 do IMNV foi de 227 cópias de trancritos de vírus em hemócitos. Esses ensaios foram utilizados para testar um eicosapeptídeo, denominado Ctn[15-34], derivado de uma catelicidina, uma classe de peptídeos antimicrobianos. O peptídeo Ctn[15-34] inibiu a citotoxicidade do IMNV (CI50) com concentrações entre 0,75 e 12,5 μM. Sendo assim, o presente estudo relata pela primeira vez a replicação do IMNV in vitro e o emprego de uma metodologia direta para avaliar a viabilidade celular de hemócitos que, por sua vez, suportam a replicação viral, bem como, aplica um sistema para a triagem de substâncias com atividade antiviral e citoprotetora. Ademais, este trabalho demonstra a atividade antiviral do eicosapeptídeo Ctn[15-34], de utilidade para o desenvolvimento de análogos, bem como para compor formulações contra doenças epizoóticas de natureza viral que afetam o camarão marinho e a aquicultura.
Abstract: Shrimp farming has become a very representative industry worldwide, dealing with over millions of tons of products. It is an important economic activity in tropical countries like Brazil. However, the activity has been facing recurrent outbreaks of epizootics, causing heavy losses for the sector. The problems have been mainly caused by the spread of viruses. Infectious myonecrosis virus (IMNV) is one of these epizootic agents that affect shrimp production in Brazil. In the main Brazilian region of shrimp production, it is known that a reduction in the salinities of cultured farms causes viral diseases, that is, when the rainy season of each year begins. However, there are no drugs on the market available to treat or prevent recurrent outbreaks of farm viruses. Therefore, the objective was to study a replication of the IMNV in vivo and in vitro and to test the potential antiviral activity of the Ctn [15-34]. In view of this, a study of the replication of IMNV at controlled salinity levels during the first 12 hours of in vivo infection was carried out, as well as the development of an in vitro assay system using Litopenaeus vannamei hemocytes in culture with the objective to obtain the inhibitory concentration (IC50) of the virus in these cells, together with the search for antiviral substances. Using real-time quantitative PCR and statistical analysis, we found that low salinity facilitates the replication and proliferation of IMNV in vivo, reducing the generation time from 57.4 min (at 35 g L-1, ideal salinity) to 25.2 min to (5 g L-1, stress concentration). Likewise, a positive correlation between the decrease in salinity and the reduction in the time of generation of another virus, hypodermic and hematopoietic infectious necrosis virus (IHHNV) was demonstrated. The IHHNV has a high prevalence rate and normally co-infects shrimps in nurseries where the IMNV emerges as outbreaks. With respect to in vitro replication, fluorescence-based cytotoxicity assays, in combination with quantitative PCR, demonstrated in this work that the IC50 of the IMNV was 227 copies of virus transcripts in hemocytes. Theses assays were then used to test an eicosapeptide, named Ctn[15-34], derived from a cathelicidin, a class of antimicrobial peptides. The peptide Ctn[15-34] inhibited IMNV cytotoxicity (IC50) with concentrations between 0.75 and 12.5 μM. Thus, the present study reports for the first time the replication of the IMNV in vitro and the use of a direct methodology to evaluate the cellular viability of hemocytes that, in turn, support viral replication, as well as apply a system for screening of substances with antiviral and cytoprotective activity. In addition, it demonstrates the antiviral activity of the eicosapeptide Ctn[15-34] for the development of analogues to compose formulations against epizootic diseases of viral nature that affect marine shrimp and aquaculture.
Description: VIEIRA, Patrícia Raquel Nogueira. Estudo in vivo e in vitro da infecção viral por IMNV e desenvolvimento de um sistema de ensaio em hemócitos de camarão marinho Litopenaeus vannamei visando a prospecção de agentes antivirais. 2017. 132 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/29819
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