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Title in Portuguese: Efeito da mistura de triterpenos alfa e beta-amirina, isolada de Protium heptaphyllum, sobre a adipogênese in vitro
Title: Effect of the mixture of triterpenes alpha and beta-amyrin isolated from Protium heptaphyllum on adipogenesis in vitro
Author: Melo, Karina Moura de
Advisor(s): Santos, Flávia Almeida
Keywords: Adipócitos
Obesidade
Células 3T3-L1
Produtos Biológicos
Issue Date: 8-Dec-2017
Citation: MELO, K. M. Efeito da mistura de triterpenos alfa e beta-amirina, isolada de Protium heptaphyllum, sobre a adipogênese in vitro. 2017. 85 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017.
Abstract in Portuguese: A obesidade é definida pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como o acúmulo anormal e excessivo de gordura corporal, que causa prejuízos à saúde. Esta condição está associada a diversas comorbidades, tais como diabetes mellitus tipo 2, problemas cardiovasculares, dislipidemias e câncer. A epidemia global da obesidade tem levado a diversos estudos sobre a sua fisiologia e à busca de novos tratamentos para esta doença. A linhagem celular fibroblástica 3T3-L1 é bastante utilizada para o estudo da diferenciação dos adipócitos in vitro, por constituir uma cultura de células estável e que se assemelha ao próprio tecido adiposo. Estudos com esta linhagem mostraram que diversos triterpenos possuem capacidade de inibir a diferenciação destas células, tais como o ácido ursólico e o ácido oleanólico. A mistura de triterpenos α,β-amirina é o principal constituinte da resina de Protium heptaphyllum (almecegueira). Assim como a resina de P. heptaphyllum, a mistura de α,β-amirina mostrou ação antiobesidade em camundongos. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de α,β-amirina sobre a adipogênese das células 3T3-L1, por meio de coloração com Oil Red O e análise da expressão protéica (Western Blot) e gênica (qPCR) de importantes fatores de transcrição envolvidos neste processo. O ensaio do MTT mostrou que a α,β-amirina não causa redução da viabilidade celular nas concentrações de 3,125; 6,25; 12,5; 25; 50 e 100 μg/mL sobre as células indiferenciadas; contudo, causa redução na viabilidade em 61,5% e 87% nas concentrações de 200 e 400 μg/mL, respectivamente. Já sobre as células diferenciadas, as concentrações de 100, 200 e 400 μg/mL causaram redução na viabilidade celular em 21,9; 83,2 e 94,7%, respectivamente. Os resultados de Oil Red O mostram que a α,β-amirina nas concentrações de 6,25; 12,5; 25 e 50 μg/mL reduziu em 34, 44, 68 e 75%, respectivamente, o acúmulo de lipídeo nas células 3T3-L1 quando comparada ao grupo controle (p<0,05). As concentrações de 12,5; 25 e 50 μg/mL foram escolhidas para os demais experimentos. As concentrações de 25 e 50 μg/mL de α,β-amirina reduziram significativamente (p<0,05) a expressão protéica de PPARγ em 54 e 54,8%, respectivamente. As concentrações de 12,5; 25 e 50 μg/mL reduziram (p<0,05) a expressão proteica de C/EBPα em 50,9; 50,1 e 62%, respectivamente, e a concentração de 50 μg/mL reduziu em 41,1% a expressão de SREBP-1. A α,β-amirina não modifica a expressão proteica de C/EBPβ e não participa da fosforilação de AMPKα em nenhuma das concentrações testadas. A α,β-amirina nas concentrações 12,5; 25 e 50 μg/mL reduz significativamente (p<0,05) a expressão gênica de PPARγ2 em 1,7, 1,3 e 1,9 vezes, respectivamente. A expressão gênica de C/EBPα foi reduzida (p<0,05) em 1,9; 2,1 e 7,3 vezes nas concentrações testadas e não houve alteração na expressão gênica de C/EBPβ e C/EBPδ. Assim, a α,β-amirina reduz a diferenciação de células 3T3-L1 regulando negativamente a expressão de fatores de transcrição chaves da adipogênese. Através destes resultados, essa mistura de triterpenos torna-se uma possível candidata para o desenvolvimento de novas substâncias para o controle da adipogênese.
Abstract: The obesity is defined by World Health Organization as the abnormal and excessive accumulation of body fat, which causes health damage. This condition is associated with several comorbidities, such as type 2 diabetes mellitus, cardiovascular diseases, dyslipidemias and cancer. The global epidemic of obesity has led to several studies on its physiology and the search for new treatments for this disease. The 3T3-L1 fibroblast cell line is widely used for the study of adipocyte differentiation in vitro, since it is a stable cell culture that resembles adipose tissue itself. Studies with this lineage have shown that several triterpenes could inhibit the differentiation of these cells, such as ursolic acid and oleanolic acid. The mixture of α,β-amyrin triterpenes is the main constituent from resin of Protium heptaphyllum (“almecegueira”). Like P. heptaphyllum resin, the α,β-amyrin mixture showed antiobesity action in mice. The aim of this work was to evaluate the effect of α,β-amyrin on the adipogenesis of 3T3-L1 cells by staining with Oil Red O and analysis of protein expression (Western Blot) and gene expression (qPCR) of important transcription factors involved in this process. MTT assay showed that α,β-amyrin didn’t cause cell viability reduction at concentrations of 3.125; 6.25; 12.5; 25; 50 and 100 μg/mL on undifferentiated cells; however, it causes viability reduction in 61.5% and 87% in concentrations of 200 and 400 μg/mL, respectively. On differentiated cells, concentrations of 100, 200 and 400 μg/mL caused a reduction in cell viability in 21.9; 83.2 and 94.7%, respectively. Results of Oil Red O show that α,β-amyrin at concentrations of 6.25; 12.5; 25 and 50 μg/mL reduced the accumulation of lipid in 3T3-L1 cells in 34, 44, 68 and 75%, respectively, when compared to the control group (p<0.05). Concentrations of 12.5; 25 and 50 μg/mL were chosen for the other experiments. Concentrations of 25 and 50 μg/mL α,β-amyrin significantly reduced (p<0.05) the protein expression of PPARγ in 54 and 54.8%, respectively. Concentrations of 12.5; 25 and 50 μg/ mL reduced (p<0.05) the protein expression of C/EBPα in 50.9; 50.1 and 62%, respectively, and the concentration of 50 μg/mL reduced the expression of SREBP-1 in 41.1%. The α,β-amyrin doesn’t modify C/EBPβ protein expression and it doesn’t participate in AMPKα phosphorylation at any of the concentrations tested. The α,β-amyrin at concentrations 12.5; 25 and 50 μg/mL significantly reduced (p<0.05) the PPARγ2 gene expression by 1.7, 1.3 and 1.9-fold, respectively. Gene expression of C/EBPα was reduced (p<0.05) in 1.9; 2.1 and 7.3-fold at the concentrations tested and there was no change in the C/EBPβ and C/EBPδ gene expression. Thus, α,β-amyrin reduces the differentiation of 3T3-L1 cells by down-regulation expression of key transcription factors of adipogenesis. Through these results, this mixture of triterpenes becomes a possible candidate for the development of new substances for the control of adipogenesis.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/29855
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