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Título: Efeito do tratamento hidrotérmico com esponja de colágeno impregnadas com nanopartículas de hidroxiapatita na proliferação e ativação de osteoblastos e avaliação de sua biocompatibilidade (in vitro/in vivo)
Título em inglês: Effect of hydrothermal treatment with collagen sponge impregnated with hydroxyapatite nanoparticles on the proliferation and activation of osteoblasts and evaluation of their biocompatibility (in vitro / in vivo)
Autor(es): Freire, Gildenio Estevam
Orientador(es): Leitão, Renata Ferreira de Carvalho
Coorientador(es): Ferreira, Júlio Cesar Góes
Palavras-chave: Osteoblastos
Poríferos
Teste de Materiais
Data do documento: 6-Fev-2018
Citação: FREIRE, G. E. ; LEITÃO, R. F. C. L. ; FERREIRA, J. C. G. (2018)
Resumo: O presente trabalho avaliou o efeito de esponjas de colágeno carreadas com diferentes concentrações de nanohidroxiapatita, desenvolvidas por nosso grupo de pesquisa, em osteoblastos murinos em cultivo celular, assim como a sua biocompatibilidade no dorso de ratos Wistar. A viabilidade e proliferação celular foram avaliadas através do ensaio MTT e imunomarcação para Ki-67, respectivamente, após 24 e 48 horas de incubação dos osteoblastos com as esponjas de colágeno carreadas com concentrações diferentes de nanohidroxiapatita. (CHAP0h CHAP2h e CHAP5h). Osteoblastos incubados com esponjas de colágeno já utilizadas comercialmente (C) e esponjas de colágeno sem hidroxiapatita preparadas por nosso grupo (COL) foram utilizadas como grupos controle. A quantificação dos níveis de fosfatase alcalina óssea (FAO) no meio de cultura após 24h, 48h, 5 dias e 7 dias de incubação foi um dos parâmetros utilizados para investigar a atividade dos osteoblastos, além do ensaio de mineralização pela coloração de Von Kossa, após 21 dias de cultivo celular. Para a investigação dos mecanismos envolvidos na ativação celular, a expressão protéica de BMP-2 foi investigada via Western blot após 7 dias de incubação. A morfologia celular foi avaliada através de microscopia eletrônica de varredura. Nos estudos in vivo para a avaliação da biocompatibilidade, investigou-se a resposta inflamatória induzida pela implantação das esponjas no dorso de ratos Wistar machos em diferentes tempos de observação. Os animais foram divididos em 3 grupos experimentais de 12, 12 e 6 animais, respectivamente, baseados em diferentes períodos de observação (24 horas, 7 e 15 dias), sendo os grupos (1) Controle: esponjas de colágeno comerciais; (2) Esponjas de colágeno produzida pelo nosso grupo; (3) esponjas de colágeno produzida pelo nosso grupo carreadas com nano particulas de Hidroxiapatita. Totalizou-se um número de 30 animais. Considerou-se os seguintes parâmetros: número de células inflamatórias ao redor das esponjas, quantificação das concentrações de mieloperoxidase (MPO) e citocinas IL-1β e TNF-α nos tecidos coletados através de ELISA e imunohistoquímica, além da quantificação de colágeno, utilizando o software image J, no tecido subcutâneo ao redor das esponjas. Após 48 horas de incubação, observou-se, no grupo CHAP5h, aumento significativo do número de células víaveis e Ki-67 positivas. Esse mesmo grupo apresentou mineralização mais intensa comparado aos grupos controle, além de aumento significativo da atividade da FAO e expressão de BMP-2 após 7 dias de cultivo celular. MEV revela a presença de cristais hexagonais de hidroxiapatita com alto teor de fósforo. In vivo, o grupo CHAP5h apresentou menor migração de células inflamatórias, quantificada 1 e 7 dias após a implantação, e menor imunomarcação para IL-1β no 7o dia, associado ao aumento da síntese de colágeno, avaliado 15 dias após a implantação das esponjas. Os resultados sugerem um efeito positivo do grupo CHAP5h na proliferação, viabilidade e ativação de osteoblastos, possivelmente devido a maior expressão de BMP-2 e atividade da FAO. A associação dos dados in vitro e da biocompatibilidade constatada no estudo in vivo, sugere fortemente o uso desse biomaterial na regeneração de defeitos ósseos, especialmente defeitos críticos.
Abstract: The biocomposites of collagen and hydroxyapatite have been widely used in bone defects treatment, allowing the drug delivery and growth factors, as well as serving as scaffold. They also present osteogenic activity by mechanisms not yet clarified. We evaluated the effect of collagen sponges impregnated with different concentrations of nanohydroxyapatite developed by our research group on murine osteoblasts in culture, as well as the biocompatibility of these materials on the back of Wistar rats. Cell viability and proliferation were evaluated by the MTT assay and Ki67 immunolabeling, respectively, after 24 and 48 hours of the osteoblasts incubation with the collagen sponges impregnated with different concentrations of nanohydroxyapatite (CHAP2h and CHAP5h).Osteoblasts incubated with commercially used collagen sponges (C) and collagen sponges without hydroxyapatite prepared by our group (COL and CHAP0h) were used as control groups. The quantification of bone alkaline phosphatase (FAO) levels in the culture medium after 24h, 48h, 5 days and 7 days of incubation was one of the parameters used to investigate the activity of osteoblasts, besides the mineralization test by Von Kossa, after 21 days of cell culture. For the investigation of the mechanisms involved in cell activation, the protein expression of BMP-2 was investigated by Western Blot after 7 days of incubation. The cell morphology was evaluated by scanning electronic microscopy. In the in vivo studies for the evaluation of biocompatibility investigated the inflammatory response induced by the implantation of sponges on the back of male Wistar rats at different observation times. The animals were divided into 3 experimental groups of 12, 12 and 6 animals, respectively, based on different observation periods (24 hours, 7 and 15 days), and the groups were: Control: commercial collagen sponges; (2) Collagen sponges produced by our group; (3) collagen sponges produced by our group carried with nano particles of Hydroxyapatite. A total of 30 animals were added. The following parameters were considered: number of inflammatory cells around the sponges, quantification of myeloperoxidase concentrations (MPO) and cytokines IL-1β and TNF-α in tissues collected by ELISA and immunohistochemistry, as well as quantification of collagen, through the J image software in the subcutaneous tissue around the sponges. After 48 hours of incubation, we observed a significant increase in the number of viable and Ki-67 positive cells in the CHAP5h group.This same group showed more intense mineralization compared to the control groups, besides a significant increase of the FAO activity and expression of BMP-2 after 7 days of incubation. SEM also reveals the presence of hexagonal crystals of hydroxyapatite with high phosphorus content. In vivo, the CHAP5h group showed less migration of inflammatory cells, quantified 1 and 7 days after implantation, and lower IL-1β immunolabeling on the 7th day, associated with the increase in IL-1β collagen synthesis, evaluated 15 days after sponge implantation. The results suggest a positive effect of the CHAP5h group on the proliferation, viability and activation of osteoblasts, possibly due to increased expression of BMP-2 and FAO. The association of the in vitro data and the biocompatibility found in the in vivo study strongly suggests the use of this biomaterial in the regeneration of bone defects.
Descrição: FREIRE, G. E. Efeito do tratamento hidrotérmico com esponja de colágeno impregnadas com nanopartículas de hidroxiapatita na proliferação e ativação de osteoblastos e avaliação de sua biocompatibilidade (in vitro/in vivo). 76 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Morfofuncionais) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2018.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/31666
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