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Title in Portuguese: Estudo dos mecanismos e mediadores envolvidos no efeito antinociceptivo e anti-inflamatório das proteínas isoladas do látex de Himatanthus drasticus em camundongos
Title: Study of mechanisms and mediators involved in the antinociceptive and anti-inflamatory effects of laticifer proteins of Himatanthus drasticus in mice
Author: Marques, Larisse Mota
Advisor(s): Alencar, Nylane Maria Nunes
Keywords: Óxido Nítrico
Nociceptividade
Dor
Imuno-Histoquímica
Issue Date: 14-Dec-2017
Citation: MARQUES, L. M. Estudo dos mecanismos e mediadores envolvidos no efeito antinociceptivo e anti-inflamatório das proteínas isoladas do látex de Himatanthus drasticus em camundongos. 2017. 117 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017.
Abstract in Portuguese: As proteínas isoladas do látex de Himatanthus drasticus (HdLP) apresentam potencial farmacológico em modelos experimentais de dor e inflamação. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de HdLP e os possíveis mecanismos de ação, por meio de modelos experimentais aprovados pela CEUA/UFC (no 51/14). Camundongos Swiss machos (20-25 g) foram pré-tratados com HdLP (0,5 a 100 mg/Kg) por via endovenosa (e.v.) 30 min antes da aplicação do estímulo nocivo. Para um screening da atividade antinociceptiva de HdLP, foram realizados testes de nocicepção induzidos pela injeção intraperitoneal (i.p.) de ácido acético ou intraplantar (i.pl.) de formalina, capsaicina ou glutamato. O envolvimento de receptores opioides foi avaliado no teste da formalina pela administração prévia de naloxona s.c. (2 mg/Kg). Para a avaliação do efeito central, os animais foram submetidos ao estímulo da placa quente (55 oC) 30, 60, 90 e 120 min após tratamento com HdLP. O efeito e os mecanismos envolvidos na ação de HdLP foi avaliado na hiperalgesia mecânica (Von Frey eletrônico) e edema de pata (pletismômetro) induzidos por carragenina (Cg) 1, 3 e 5 h após injeção i.pl. de Cg. A hiperalgesia mecância também foi avaliada 3 h após administração de PGE2 ou dopamina. Os animais foram eutanasiados 3 h após Cg e as patas coletadas para avaliação da atividade de mieloperoxidase (MPO), concentração de mediadores inflamatórios (TNF-α, IL-1β, KC, IL-10), análise histopatológica, expressão de TNF-α por Western-Blot, análise imuno-histoquímica (COX-2, NOSi) e determinação do estresse oxidativo (MDA, GSH, SOD, CAT). O envolvimento de NO, GMPc e canais de K+ sensíveis ao ATP foi investigado por meio da administração prévia de L-NMMA, ODQ ou glibenclamida, respectivamente, na hiperalgesia mecânica por PGE2. A produção de NO in vitro foi determinada em sobrenadante de cultura de macrófagos (RAW 264.7) incubados com HdLP (25, 50, 100 μg/ml) e ativados com LPS (24 h). Para as análises estatísticas, utilizou-se o teste ANOVA/Newman Keuls ou Kruskal Wallis/Dunns, considerando-se significante p<0,05. HdLP reduziu a nocicepção induzida por ácido acético, formalina (em ambas as fases), capsaicina e glutamato, sendo o efeito revertido pela administração prévia de naloxona no teste da formalina. HdLP promoveu antinocicepção tempo e dose-dependentes no teste da placa quente e nos testes de hiperalgesia mecânica por carragenina e reduziu o edema de pata induzido por carragenina. HdLP também reduziu a hiperalgesia promovida por PGE2 ou dopamina. O efeito de HdLP na hiperalgesia por PGE2 foi revertido pela administração prévia de L-NMMA, ODQ e glibenclamida. O pré-tratamento com HdLP reduziu a atividade de MPO e as concentrações de TNF-α e IL-1β enquanto aumentou a concentração de IL-10. A expressão de TNF-α e a imunomarcação de COX-2 foram reduzidas e a atividade de SOD foi elevada. Não houve alteração nos níveis de KC, CAT, GSH e MDA nem na expressão e NOSi ou produção in vitro de NO. Em conjunto, os resultados apontam o potencial antinociceptivo e anti-inflamatório de HdLP, sugerindo um efeito sobre mediadores inflamatórios e sobre componentes neuronais.
Abstract: There is a constant search for analgesic drugs to control the pain while promoting as few side effects as possible. This study aimed to evaluate the effect of a latex protein fraction from Himathantus drasticus (HdLP) in experimental models of nociception after approval by the CEUA/UFC (n° 51/14). Male Swiss mice (20-25g) were pretreated with HdLP e.v. 30 min before noxious stimuli and it were evaluated by measures of nociceptive behavior. HdLP (0.5, 5 and 10 mg/kg) was investigated in the test models of nociception induced by acetic acid (i.p), formalin (i.pl), capsaicin (i.pl.) or glutamate (i.pl). Involvement of opioid system was evaluated using formalin test by prior injection of naloxone s.c. (2 mg/kg). To assess thermal nociception, mice were placed on a hot plate (55 oC) 30, 60, 90 and 120 minutes after HdLP treatment (0.5, 5 and 50 mg/kg). The HdLP antihyperalgesic effect (0.5, 5 and 50 mg/kg) was evaluated using mechanical models of hyperalgesia induced by carrageenan, PGE2 or dopamine by the electronic Von Frey method 1, 3 and 5 h after carrageenan or 3 h after PGE2 or dopamine. Anti-inflammatory effects were investigated using the test of paw edema induced by carrageenan. Animals were euthanized 3 h after carrageenan and paws were collected for evaluation of myeloperoxidase activity (MPO), inflammatory mediators production (TNF-α, IL-1β, KC and IL-10), histopathological analysis, Western blot analysis of TNF-α, immunohistochemical assays (COX-2, NOSi) and levels of oxidative stress (MDA, GSH, SOD, CAT). Involvement of the NO/cGMP/K+ channels pathway was investigated by prior administration of L-NMMA, ODQ or glibenclamide, respectively, in PGE2-induced hyperalgesia. To investigate mechanisms underlying HdLP anti-inflammatory action, we investigated the effect of HdLP (25, 50, 100 μg/ml) on LPS-induced responses in a murine macrophage cell line, RAW 264.7. Statistical analyzes were performed using ANOVA/Newman Keuls or Kruskal Wallis/Dunns test and p<0.05 was considered significant. HdLP significantly reduced the nociception induced by acetic acid, formalin (in both phases), capsaicin and glutamate in a dose-dependent manner. This effect was reversed by previous administration of naloxone in the formalin test. HdLP was found to be effective in hot plate test, carrageenan-induced hyperalgesia and paw edema in a time- and dose-dependent manner. HdLP also reduced PGE2-and dopamine-induced hyperalgesia. The effect of HdLP on PGE2-induced hyperalgesia was reversed by prior administration of L-NMMA, ODQ and glibenclamide. Pre-treatment with HdLP decreased MPO activity and TNF-α and IL-1β production and increased IL-10 release. TNF-α expression by western blot and COX-2 expression by immunohistochemistry were decreased and SOD activity was increased. There was no change in KC, CAT, GSH and MDA levels or NOSi expression and NO release in vitro. The present results suggest that HdLP exhibits antinocieptive effect in mice by inhibiting neutrophil migration, release of proinflammatory cytokines (TNF-α, IL-1β) and expression of inflammatory mediators (COX-2), as well as releasing anti-inflammatory cytokine IL-10. Furthermore, opioid system and L-arginine/NO/cGMP/K+ pathway seems to be responsible, at least in part, for the antinociceptive effect of HdLP.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/33778
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