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Title in Portuguese: Paclitaxel reduz o crescimento tumoral através da reprogramação de macrófagos associados ao tumor para o perfil M1 via TLR4
Title: Paclitaxel reduces tumor growth by reprogramming tumor-associated macrophages to M1-profile via TLR4
Author: Wanderley, Carlos Wagner de Souza
Advisor(s): Lima Júnior, Roberto César Pereira
Co-advisor(s): Cunha, Fernando de Queiroz
Keywords: Polarização de macrófagos
Microambiente Tumoral
Issue Date: 20-Aug-2018
Citation: WANDERLEY, C. W. S. Paclitaxel reduz o crescimento tumoral através da reprogramação de macrófagos associados ao tumor para o perfil M1 via TLR4. 2018. 84f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2018.
Abstract in Portuguese: O paclitaxel (PCX) é um agente antineoplásico amplamente utilizado no tratamento de vários tipos de tumores sólidos. O mecanismo primário de ação dessa droga é baseado na estabilização de microtúbulos, indução de parada mitótica e consequente apoptose de células que proliferam rapidamente. No presente estudo, investigou-se a capacidade do PCX de reprogramar a resposta imune antitumoral mediante modulação do fenótipo funcional de macrófagos associados ao tumor (TAMs), bem como avaliou-se a dependência dos receptores TLR4 na realização desse processo. Macrófagos da medula óssea de camundongos selvagens (do inglês Wild type [WT]) ou TLR4 knockout; em estado basal de ativação (naive - macrófago M0), ou previamente polarizados para o perfil M2 com IL-4 (10 ng/mL por 24h) foram estimulados com PCX (10, 30, 100 μM), ou LPS (100 ng/mL). Após 48 horas, marcadores de polarização de macrófagos M1 e M2 foram avaliados por citometria e ELISA. Além disso, camundongos WT, TLR4 knockout ou com deleção condicional de TLR4 em macrófagos (LysM-Cre+/-/TLR4fl/fl) foram inoculados com linhagens celulares murinas de câncer de mama (4T1), ou melanoma (B16) e tratados com salina ou PCX. Em seguida, os tumores foram colhidos e os TAMs isolados em gradientes de percoll (seleção positiva) para caracterização fenotípica por qRT-PCR. Ainda, foi realizada análise de bioinformática do transcriptoma de biópsia de pacientes com câncer de ovário obtidas antes e após 3 ciclos de terapia com PCX (GSE15622) com foco na identificação de assinaturas imunológicas. Em condições in vitro, o estímulo com PCX polarizou macrófagos naive M0 para o sentido M1, bloqueou a polarização para o perfil M2 e reprogramou macrófagos M2 para o fenótipo M1, via ativação dos receptores TLR4, de maneira similar ao LPS. Em seguida, foi observado que parte do efeito antitumoral do PCX estava associado a modulação do perfil fenotípico dos TAMs. A análise da expressão gênica de TAMs isolados de tumores de camundongos tratados com PCX, mostrou uma redução na expressão de marcadores M2 (cd206, relmα, mmp9 e arg1) e um aumento na expressão de genes característicos de macrófagos M1 (il12, inos e il6) que foi associada a redução do crescimento tumoral. Para confirmar se o mecanismo imune do PCX envolvia a polarização de TAMs via TLR4, foram gerados camundongos com deleção seletiva de TLR4 em macrófagos (LysM-Cre+/-/TLR4fl/fl). Notadamente, o efeito antitumoral do PCX foi reduzido nos camundongos LysM-Cre+/-/Tlr4fl/fl. Além disso, a análise de enriquecimento gênico realizada nas biópsias tumorais de pacientes antes e após o tratamento com PCX, demonstrou que o PCX aumenta a expressão de genes ligados a macrófagos com perfil M1, nesses tumores. Esses dados indicam que o PCX promove a polarização de TAMs para um perfil imunocompetente M1 via TLR4, e esse efeito contribui para sua eficácia antitumoral.
Abstract: Paclitaxel (PCX) is an antineoplastic agent widely used to treat several solid tumor types. The primary mechanism of action of this drug is based on microtubule stabilization and induction of mitotic arrest leading to cells that proliferate rapidly to apoptosis. Here, was investigated whether PCX could reprogram the antitumor immune response by modulating the functional phenotype of tumor-associated macrophages (TAMs), as well as the involvement of TLR4 receptors on this process. Bone marrow macrophages from wild-type (WT) or TLR4 knockout mice in basal state of activation (naïve, M0) or previously polarized to M2-profile with IL-4 (10 ng/mL) were stimulated with PCX (10, 30, 100 μM) or LPS (100 ng/mL). After 48h, M1 and M2 markers of polarization status were measured by cytometry and ELISA. Furthermore, mice WT, TLR4 knockout or with a conditional deletion of TLR4 on macrophages (LysM-Cre+/-/TLR4fl/fl) were inoculated with murine breast cancer (4T1) or melanoma (B16) cell lines and treated with saline or PCX. Following, the tumors were harvested and the TAMs isolated by standard percoll (positive selection) for phenotype analysis by qRT-PCR. A bioinformatical analysis of an online database containing biopsy transcripts from patients with ovarian cancer obtained before and after 3 cycles of PCX therapy (GSE15622) was performed with focus on immunological signatures. In in vitro conditions, PCX polarized naive M0 macrophages to the M1-profile, blocked the M2-polarization and reprogrammed M2-polarized macrophages to the M1 phenotype in a TLR4-dependent manner, similarly to LPS. Accordingly, was observed that PCX played an antitumor effect through modulating the TAMs profile. Gene expression analysis of TAMs from tumors of PCX treated mice showed reduced expression of M2 markers (cd206, relmα, mmp9 and arg1) and up-regulation of M1 linked genes (Il12, inos and Il6). To confirm whether the PCX immune mechanism involved TAMs polarization via TLR4, we used mice selectively lacking TLR4 on macrophages (LysM-Cre+/-/TLR4fl/fl). Strikingly, the antitumor effect of PCX was significantly reduced in LysM-Cre+/-/TLR4fl/fl mice. Furthermore, the gene expression dataset analysis indicated an enrichment of genes linked to M1-profile in tumor biopsies from PCX treated patients. These findings indicate that PCX skews TAMs towards an M1 immunocompetent profile via TLR4 and this effect may contribute to the antitumor efficacy of PCX.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/34977
metadata.dc.type: Tese
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