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Título: Estaurosporinas de Eudistoma vannamei : química e bioatividade
Título em inglês: Staurosporines from Eudistoma vannamei : chemistry and bioactivity
Autor(es): Jimenez, Paula Christine
Orientador(es): Costa-Lotufo , Letícia Veras
Palavras-chave: Estaurosporina
Ciclo Celular
Data do documento: 2009
Citação: JIMENEZ, P. C. (2009)
Resumo: Eudistoma vannamei (Millar, 1977) é uma ascídia endêmica do litoral do Nordeste brasileiro, largamente encontrado nas praias rochosas do estado do Ceará. Previamente, o extrato bruto apresentou um interessante perfil em termos de bioatividade. O fracionamento bioguiado identificou uma mistura 1:1 altamente citotóxica, contendo dois derivados inéditos de estaurosporina, 2-hidroxi-7-oxoestaurosporina (I) e 3-hidroxi-7-oxoestaurosporina (II). IC50 para I/II e estaurosporina (STP) foram obtidas após 72h de incubação com diversas linhagens de células tumorais, utilizando-se o ensaio do MTT, e em linfócitos humanos normais, através do ensaio de AlamarBlue. I/II superou a citotoxicidade de STP em 7 vezes, em média, para as células tumorais, ao passo que mostrou-se tão ativa quanto frente às células normais. Uma análise cinética sobre a progressão de ciclo celular, ativação de resposta a dano e vias de reparo de DNA, e indução de apoptose de células HL-60 (leucemia) foi conduzida com 40 ou 80ng/mL I/II e acessada por citometria de fluxo e western blotting. Estudos de ciclo celular indicaram que I/II (40ng/mL) induz bloqueio de ciclo celular em G2/M e que este efeito prossegue irreversível mediante a remoção do estímulo. STP (200ng/mL) induziu o bloqueio quase que completo em G2/M após 24h de incubação, enquanto períodos mais longos de incubação provocam um aumento substancial de células poliplóides. A expressão de proteínas envolvidas no controle do ciclo celular (Cdk1, Cdk2, ciclina A e ciclina B1), associada à observação morfológica de células tratadas com 40ng/mL I/II e coradas com H/E em lâminas de vidro sugere que o bloqueio está ocorrendo, de fato, na fase G2. O bloqueio em G2 foi parcamente observado em células tratadas com 80ng/mL I/II, conquanto características apoptóticas fizeram-se deveras evidentes. A avaliação de dano à fita dupla de DNA através do teste do cometa neutro indica a indução apenas de baixo nível de dano de DNA em células tratadas com 40ng/mL I/II por 24, 48 ou 72h. Entretanto, células tratadas com 80ng/mL I/II exibiram níveis mais elevados de dano. A expressão de proteínas relacionadas a dano de DNA (ATM e H2A.X) deu-se numa forma tempo- e concentração-dependente, enquanto o bloqueio de ciclo e os marcadores de reparo (Chk1, Cdc25C, BRCA1) foram ativados, predominantemente, em células tratadas com 40ng/mL I/II. Inversamente, a externalização de PS e a ativação das caspases efetoras 3 e 7 e de PARP mostraram-se altamente expressos em células tratadas com 80ng/mL I/II mostrou um claro efeito citostático em células HL-60 na menor concentração testada, evidenciado pelo persistente bloqueio de ciclo celular e baixo dano em DNA; e um objetivo efeito citotóxico na concentração maior, motivado pelo extensivo dano em DNA e indução de apoptose.
Abstract: Eudistoma vannamei Millar, 1977 is an endemic tunicate from the northeastern Brazilian coast, widely distributed over the rocky beaches of Ceará State. Previously, the crude extract showed an interesting bioactivity profile. Bioassay-guided fractionation yielded a highly cytotoxic 1:1 mixture identified as two novel staurosporine derivatives, 2-hydroxy-7-oxostaurosporine (I) and 3-hydroxy-7-oxostaurosporine (II). IC50 for I/II and staurosporine (STP) were obtained after 72h incubation with various tumor cell lines using the MTT assay and in normal human lymphocytes, by the AlamarBlue assay, where I/II outperformed STP in a 7-fold average. On normal cells, I/II showed to be equally effective as STP and, thus, showed a 25-fold average selectivity towards tumor cells. A kinetic analysis on cell cycle progression, activation of DNA damage and repair pathways and apoptosis induction of HL-60 cells (leukemia), was carried out with 40 or 80ng/mL I/II and accessed by flow cytometry and western blotting. Cell cycle studies indicated that I/II induces a G2-M arrest (at 40ng/mL, 45, 63 and 94% of arrested cells after 24, 48 and 72h treatment, respectively, against 9, 10 and 13% for the non-treated culture). Moreover, 24h-G2/M arrest is sustained and irreversible following removal of stimuli. STP induces 83% G2/M arrest at 200ng/mL after 24h incubation, whilst longer incubation periods provoke a substantial increase in polyploidy. Expression-rate of cell cycle related proteins (Cdk1, Cdk2, cyclin A and cyclin B1) paired with morphological observation of 40ng/mL I/II-treated H/E-stained cells placed on glass slides suggest that arrest is actually occurring at the G2 phase. G2 arrest is merely seen in 80ng/mL I/II-treated cells, while apoptotic features were quite evident. Double-strand breaks evaluated by the neutral comet assay indicates only low scored DNA damage against 24, 48 or 72h 40ng/mL I/II treated cells. However, 80ng/mL I/II-treated cells exhibited higher scored damage. DNA damage proteins (ATM and H2A.X) were expressed in a time- and concentration-dependent manner; while, cycle arrest and repair markers (Chk1, Cdc25C, BRCA1) were activated mostly on 40ng/mL I/II-treated cells. Conversely, PS externalization and activation of effector caspases 3 and 7 and PARP were highly blotted mostly for 80ng/mL I/II-treated cells. I/II induced a clear cytostatic effect on HL-60 cells at the lower concentration, distinguished by persistent cell cycle arrest and low DNA damage; and an objective cytotoxic effect at the higher concentration, motivated by extensive DNA damage and induction of apoptosis.
Descrição: JIMENEZ, Paula Christine. Estaurosporinas de Eudistoma vannamei : química e bioatividade. 2009. 150 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2009.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/3736
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