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Title in Portuguese: Alterações induzidas pela toxina A do Clostridium difficile na via WNT/B-catenina in vivo e papel do RAC-1 na sua inibição em células epiteliais intestinais
Author: Martins, Conceição da Silva
Advisor(s): Brito, Gerly Anne de Castro
Co-advisor(s): Abreu Junior, José Garcia Ribeiro
Keywords: Clostridium difficile
Proteínas rac1 de Ligação ao GTP
Proteínas Wnt
beta Catenina
Intestino
Issue Date: 5-Apr-2018
Citation: MARTINS, C. S. Alterações induzidas pela toxina A do Clostridium difficile na via WNT/B-catenina in vivo e papel do RAC-1 na sua inibição em células epiteliais intestinais. 2018. 110 f. Tese (Doutorado em Ciências Morfofuncionais) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2018.
Abstract in Portuguese: O Clostridium difficile, agente causador de diarreia e colite, produz toxina A (TcdA) e B, duas potentes enterotoxinas. Ambas as toxinas reduzem a proliferação e apoptose em células epiteliais intestinais. A via Wnt-β-catenina quando ativada estimula a proliferação e diferenciação de células epiteliais. In vitro, foi demonstrado que TcdA do Clostridium difficile inibe a via Wnt/β-catenina, mesmo na presença de agonistas da via.TcdA, assim como a toxina B, inativam Rho GTPases, inclusive Rac1. Rac1 tem importante função na translocação de β-catenina para o núcleo, que por sua vez estimula a transcrição de genes envolvidos na proliferação celular. Portanto, o objetivo desse trabalho foi estudar as alterações induzidas pela TcdA do Clostridium difficile na via Wnt/β-catenina em camundongose investigar o papel de Rac-1 na atividade inibitória dessa toxina na via Wnt/β-catenina in vitro. Injetou-seTcdA do Clostridium difficile (10 ou 50 μg/alça) ou PBS (200l; controle) na alça ileal de camundongos C57BL/6 e Swiss. Os animais foram eutanasiados sob anestesia 4 h depois e segmentos do íleo foram coletados para realizar a análise histopatológica e avaliar os componentes da via Wnt/β-catenina por imunohistoquímica (β-catenina e Wnt 3a ciclina D1), Western Blotting (β-catenina) e RT-qPCR (LGR5, cMYC, ciclina D1 e Wnt-3a, Rac1), proliferação celular (imunohistoquímica para Ki67 e ciclina D1) e expressão de Rac1 por RT-qPCR. Células epiteliais intestinais de rato (IEC-6) foram transfectadas com pcDNA3-EGFP-Rac1-Q61L ou pcDNA3 e incubadas com TcdA (50 ng/mL) na presença ou ausência de meio condicionado com Wnt-3a. Após 24h de incubação, avaliou-se a ativação da via Wnt/β-catenina (por meio do ensaio TOP/FOPflash luciferase), a translocação nuclear β-catenina por imunofluorescência e proliferação celular (imunocitoquímica para Ki67). In vivo, a TcdA do Clostridium difficile induziu acentuada destruição das vilosidades intestinais e intenso infiltrado de células inflamatórias no íleo de ambas as espécies. No íleo de camundongos Swiss, a TcdA do Clostridium difficile aumentou a expressão proteica de β-catenina e reduziu a expressão gênica de ciclina D1, enquanto que nos camundongos C57BL/6 reduziu a expressão gênica de β-catenina e cMYC, além de aumento da imunomarcação e expressão gênica de Wnt-3a e LGR5. Em adição, TcdA diminuiu a proliferação celular nas criptas intestinais e não alterou a expressão de Rac1 no íleo de ambas as espécies. Em células epiteliais intestinais (IEC-6), TcdA diminuiu a ativação da via Wnt-β-catenina pelo agonista da via (Wnt-3a), reduziu a translocação de β-catenina para o núcleo e diminuiu a proliferação. Enquanto que a transfecção de IEC-6 com pcDNA3-EGFP-Rac1-Q61L reverteu os efeitos da TcdA do Clostridium difficile na presença de Wnt-3a. Concluímos que TcdA do Clostridium difficile inibe a via Wnt/β-catenina em camundongos Swiss e C57BL/6, apesar do nível aumentando de agonista endógeno da via, sendo que os principais genes alterados foram os envolvidos na proliferação celular. Adicionalmente, os resultados in vitro mostram um importante papel da inativação de Rac1 pela TcdA do Clostridium difficile na inibição da via Wnt/β-catenina por essa toxina.
Abstract: Clostridium difficile, an agent that causes diarrhea and colitis, produces toxin A (TcdA) and B, two potent enterotoxins. Both toxins reduce proliferation and apoptosis in intestinal epithelial cells. The Wnt-β-catenin pathway, when activated, stimulates the proliferation and differentiation of epithelial cells. In vitro, Clostridium difficile TcdA of has been shown to inhibit the Wnt/β-catenin pathway, even in the presence of pathway agonists. TcdA, as well as toxin B, inactivate Rho GTPases, including Rac1. Rac1 has an important role in the translocation of β-catenin to the nucleus, which stimulates the transcription of genes involved in cell proliferation. Therefore, the objective of this study was to evaluate the changes induced by the Clostridium difficile TcdA in the Wnt/β-catenin pathway in mice and to investigate the role of Rac-1 in the inhibitory activity of this toxin in the Wnt/β-catenin pathway in vitro. TcdA of Clostridium difficile (10 or 50μg/loop) or PBS (200 μl; control) were injeted on the ileal loop of C57BL/6 and Swiss mice. The animals were euthanized under anesthesia 4h later and segments of the ileum were collected to perform the histopathological analysis and to evaluate the components of the Wnt / β-catenin pathway by immunohistochemistry (β-catenin and Wnt-3a and ciclina), Western Blotting (β-catenin) and RT-qPCR (LGR5, cMYC, cyclin D1 and Wnt-3a), cell proliferation (by immunohistochemistry for Ki67 and cyclin D1) and Rac1 expression by RT-qPCR. Mouse intestinal epithelial cells (IEC-6) were transfected with pcDNA3-EGFP-Rac1-Q61L or pcDNA3 and incubated with TcdA (50 ng/ml) in the presence or absence of Wnt-3a conditioned medium. After 24h incubation, the activation of the Wnt/β-catenin pathway (through the TOP/FOPflash luciferase assay), nuclear β-catenin translocation by immunofluorescence and cell proliferation (immunocytochemistry for Ki67) wasevaluated. In vivo, TcdA of C.diff induced marked destruction of intestinal villi and intense inflammatory cell infiltration in the ileum tissue of both species. In the ileum of Swiss mice, the TcdA of Clostridium difficile increased the protein expression of β-catenin and reduced the gene expression of cyclin D1, while in the C57BL/6 mice, this toxin reduced β-catenin and cMYC gene expression, as well as increased gene expression of Wnt-3a and LGR5. In addition, TcdA decreased cell proliferation in the intestinal crypts and did not alter the expression of Rac1 in the ileum of both species. In intestinal epithelial cells (IEC-6), TcdA decreased the activation of the Wnt-β-catenin pathway by the pathway agonist (Wnt-3a), reduced β-catenin translocation to the nucleus and decreased proliferation, while transfection of IEC-6 with pcDNA3-EGFP-Rac1-Q61L reversed the TcdA of Clostridium difficile effects in the presence of Wnt-3a. We conclude that TcdA of Clostridium difficile inhibits the Wnt/β-catenin pathway in Swiss and C57BL/6 mice, despite the increasing level of endogenous agonist of the pathway, with the main altered genes being those involved in cell proliferation. In addition, the in vitro results show an important role of Rac1 inactivation by TcdA of Clostridium difficile in the Wnt/β-catenin pathway inhibition.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/37551
metadata.dc.type: Tese
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