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Title in Portuguese: Estudo morfofuncional e dos mediadores inflamatórios envolvidos na patogênese da mucosite intestinal induzida por irinotecano (CPT-11) em camundongos : papel da caspase-1, interleucina-18 e óxido nitríco
Title: Morphofunctional study and the inflammatory mediators involved on the pathogenesis of irinotecan (CPT-11)-induced intestinal mucositis in mice : role of caspase-1, interleukin-18 and nitric oxide
Author: Lima Júnior, Roberto César Pereira
Advisor(s): Ribeiro, Ronaldo de Albuquerque
Keywords: Mucosite
Fator de Ativação de Plaquetas
Mediadores da Inflamação
Issue Date: 2008
Citation: LIMA JUNIOR, R. C. P. Estudo morfofuncional e dos mediadores inflamatórios envolvidos na patogênese da mucosite intestinal induzida por irinotecano (CPT-11) em camundongos : papel da caspase-1, interleucina-18 e óxido nitríco. 200 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2008.
Abstract in Portuguese: A Mucosite Intestinal (MI) e a diarréia severas são efeitos colaterais freqüentes (15-25%) e limitantes da quimioterapia do câncer de cólon com Irinotecano (CPT-11). Até o presente momento, pouco se conhece sobre a fisiopatologia da MI. Objetivo: Estudar os mecanismos e mediadores envolvidos na mucosite intestinal induzida por CPT-11, verificando a participação da protease caspase-1, das citocinas interleucina-1 (IL-1), interleucina-18 (IL-18) e interleucina-33 (IL-33), do óxido nítrico, de mediadores 5-lipoxigenase e do PAF, assim como a seqüência de interação entre esses mediadores sob aspectos da resposta inflamatória e morfofuncionais. Métodos: Camundongos Swiss, C57BL/6 (BL), BALB/c (BC) ou knockout para Caspase-1 (Casp-/-), IL-18 (IL-18-/-), óxido nítrico sintase induzida (iNOS-/-), 5-Lipoxigenase (5-LOX-/-), receptor para PAF (PAFr-/-) machos, 22 g, foram divididos em grupos (n=4-5) e tratados por 4 dias com salina (5 mL/kg, i.p) ou CPT-11 (60 mg/kg, i.p) ou foram pré-tratados com IL-18bp (proteína ligante de IL18, 200 µg/animal/4 dias, i.p.), aminoguanidina (AG, 50 mg/kg, s.c, 2x/dia/4 dias), IL-33 (1 µg/animal/4 dias, i.v, 1h antes do CPT-11) ou loperamida ([4x3 mg/kg e 4x30 mg/kg]/animal, s.c.) em associação com CPT-11. No 5º dia, avaliou-se a diarréia por escores, o leucograma e, após sacrifício, coletou-se o duodeno para dosagem da atividade de mieloperoxidase (MPO, neutrófilos/mg tecido) e de óxido nítrico sintase induzida (iNOS pM citrulina/h/mg proteína), morfometria (razão vilo/cripta) e contratilidade in vitro à Acetilcolina (%contração em relação ao KCl60 mM). Para análise estatística utilizou-se ANOVA/Newman-Keuls ou Kruskal Wallis/Dunn. P<0,05 foi aceito. Resultados: Camundongos BL apresentaram um padrão de mucosite intestinal similar ao observado no camundongo Swiss sob aspectos morfofuncionais. O CPT-11 induziu leucopenia em todos os animais independentemente do tratamento aplicado. Adicionalmente, o CPT-11 induziu em animais BL e BC, não tratados, aumento de MPO intestinal, redução da relação vilo/cripta, amento da contratilidade in vitro e dos eventos de diarréia comparados com animais injetados somente com salina (p<0,05). A despeito da administração de CPT-11, animais Caspase-1-/-, IL-18-/- ou BC tratados com IL-18bp apresentaram atividade de MPO e de iNOS reduzidas, bem como aumento na relação vilo/cripta, menor contratilidade duodenal in vitro e eventos de diarréia atenuados em comparação aos respectivos controles tratados com salina (p>0,05). Dados idênticos também foram observados em camundongos injetados com IL-33 e que receberam CPT-11. A redução na atividade de iNOS naqueles animais motivou o estudo do efeito do CPT-11 em animais iNOS-/- ou tratados com aminoguanidina. Observaram-se menores níveis de citocinas IL-1beta e KC, bem como uma atividade de MPO reduzida no duodeno desses animais. Além disso, verificou-se preservação da relação vilo/cripta e da espessura da camada muscular, menor contratilidade duodenal in vitro e eventos de diarréia atenuados similar ao observado nos respectivos controles que receberam apenas salina (p>0,05). Porém, a administração de CPT-11 a animais PAFr-/- foi capaz de induzir alterações morfofuncionais e o aumento da atividade de MPO intestinal. Em camundongos 5-LOX /- ou tratados com loperamida (controle positivo), ambos os grupos injetados com CPT-11, observaram-se aumento da atividade de MPO e alterações morfométricas. Contudo, sobre aspectos funcionais de contratilidade in vitro, visualizou-se proteção. Conclusões: Esses resultados sugerem que a via caspase-1-IL-18 óxido nítrico contribui para o desenvolvimento da resposta inflamatória e alterações morfofuncionais na mucosite intestinal induzida por CPT-11. A IL-33 parece ser um fator protetor compensatório nessa cascata inflamatória. A 5-LOX e o PAFr parecem ter papel secundário na patogênese da mucosite intestinal por CPT-11.
Abstract: Severe Intestinal Mucositis (IM) and diarrhea are frequent and dose-limiting side-effects of colon cancer chemotherapy with irinotecan (CPT-11). At present, much of IM pathophysiology remains unknown. Aims: To study the mechanisms and inflammatory mediators involved in CPT-11-induced intestinal mucositis, verifying the role of the protease caspase-1, cytokines interleukin-1 (IL-1), interleukin-18 (IL-18) and interleukin-33 (IL-33), nitric oxide, 5-lipoxygenase and PAF as well as the sequence of activation of these mediators in the inflammatory response and morphofunctional contexts. Methods: Swiss, C57BL/6 (BL), BALB/c (BC) male mice or caspases-1(Casp-1-/-), IL-18 (IL-18-/-), inducible nitric oxide synthase (iNOS-/-), 5-Lipoxygenase (5-LOX-/-), PAF receptor (PAFr-/-) knockout mice, 22g, were divided into groups (n=4-5) and treated for 4 days with saline (5 mL/kg, i.p.) or CPT-11 (60 mg/kg, i.p.) or were given IL-18bp (IL-18 binding protein, 200 µg/animal/4 days, i.p.), aminoguanidine (AG, 50 mg/kg, s.c, 2x/day/4 days), IL-33 (1 µg/animal/4 days, i.v, 1h previously CPT-11) or loperamide ([4x3 mg/kg and 4x30 mg/kg]/animal, s.c.) co-administered with CPT-11. On day 5, diarrhea and leukocyte counts were assessed, and following sacrifice duodenal portions of the animal were collected to assess myeloperoxidase (MPO, neutrophils/mg tissue) and nitric oxide synthase (iNOS pM citruline /h/mg protein) activity, morphometric analysis, and in vitro contractility (%contraction in relation to KCl 60 mM). ANOVA/Newman Keuls or Kruskal Wallis/Dunn were used as statistical tests. P<0.05 was accepted. Results: IM was morphofunctionally similar in both BL and Swiss. CPT-11 induced leukopenia in all animal lineages despite the treatment given. Additionally, CPT-11 induced MPO, increased in vitro contractility and diarrheic events, and villi/crypt ratio reduction in BL and BC mice in comparison with saline treated mice (p<0.05). Despite the injection of CPT-11, Casp-1-/-, IL-18-/- or IL-18bp treated BC mice presented reduced MPO and iNOS activities and also increased villi/crypt ratio, reduced duodenal in vitro contractility and mild diarrhea similar to saline-treated mice (P>0.05), similar to the patterns seen in IL-33 treated mice. The reduced iNOS activity found in the earlier mice led us to investigate the CPT-11 effect on iNOS /- and aminoguanidine-treated mice. Lower IL-1beta and KC cytokine levels, as well as reduced MPO activity were found. Also, preserved villi/crypt ratio and muscle layer thickness, normal duodenal contractility and diarrheic events were seen similarly to saline-treated mice (p>0.05). However, CPT-11-treated PAFr-/- presented morphofunctional alterations and increased intestinal MPO activity. 5-LOX-/- or loperamide treated mice (positive control), both injected with CPT-11, exhibited increased MPO activity and morphometric alterations, but no exacerbation on in vitro contractility was observable. Conclusion: Taken together, these results suggest the role of caspase-1/Interleukin-18/nitric oxide cascade on pathogenesis of CPT-11-induced morphofunctional alteration and inflammatory response (IM). IL-33 seems to be a compensatory protective factor on this inflammatory cascade. 5-LOX and PAFr show a likely secondary role on IM pathophysiology.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/3843
metadata.dc.type: Tese
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