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Title in Portuguese: Produção e processo de Downstream de lipopeptídeos fungicidas produzidos pelo Bacillus subtilis CNPMS 22
Author: Souza, Caroline Gondim de
Advisor(s): Brito, Edy Sousa de
Co-advisor(s): Canuto, Kirley Marques
Keywords: Engenharia química
Segurança alimentar - Ação antifúngica
Lipopeptides
Iturin
Fengicin
Surfactin
Bacillus subtilis
Issue Date: 26-Mar-2019
Citation: SOUZA, C. G. de. Produção e processo de Downstream de lipopeptídeos fungicidas produzidos pelo Bacillus subtilis CNPMS 22. 2019. 109 f. Tese (Doutorado em Engenharia Química)-Centro de Tecnologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2019.
Abstract in Portuguese: A busca por produtos naturais com capacidade de controlar fitopatógenos é uma necessidade crescente devido à preocupação tanto pela segurança alimentar quanto pelo meio ambiente. Neste contexto, o Bacillus subtilis se destaca devido ao seu potencial em produzir uma grande variedade de lipopeptídeos com atividade antifúngica. Portanto, o objetivo geral do presente trabalho foi quantificar, purificar e verificar a ação fungicida dos lipopeptídeos produzidos pelo B. subtilis CNPMS 22. Para tal, inicialmente foi desenvolvido e validado um método de quantificação dos lipopeptídeos em cromatografia de ultra performance com detector quadrupolo (UPLC-QDA) com o modo de monitoramento de íons (SIM). O modo SIM foi utilizado para detecção e quantificação dos lipopeptídeos exibindo íons [M + H] + para as iturinas e surfactinas e [M + 2H] 2+ para as fengicinas. Os íons monitorados foram: m / z 1043,5; 1057,5; 1071,5; 718,3; 725,4; 739,4; 732,4; 746,4; 753,4; 1008,6; 1022,6 e 1036,6. Os compostos foram separados por cromatografia líquida de fase reversa utilizando uma coluna analítica C18 num tempo total de 19 min. Posteriormente, foi realizado um estudo de ampliação de escala de fracionamento das famílias de lipopeptídeos utilizando a cromatografia líquida de alta performance (HPLC), tanto na escala semi-preparativa como na escala preparativa. Também foi avaliado a utilização da partição líquido-líquido na separação dos compostos e verificou-se a viabilidade de associação da partição com a HPLC, tanto em escala semi-preparativa e como em escala preparativa. Para os testes de ampliação de escala com HPLC diferentes cargas foram utilizadas (20, 40, 60 e 80 mg). Nesta etapa foram avaliados o consumo de solvente, produtividade e rendimento. Na partição foi realizado testes de proporções de solvente visando determinar a condição ideal para a separação dos lipopeptídeos. Em seguida, foi realizado um estudo para avaliar a atividade fungicida das famílias de lipopeptídeos e do extrato bruto, contra o Colletotrichum musae (agente da antracnose), Fusarium pallidoroseum (agente da fusariose) e o Lasiodiplodia caatigensis (agente da resinose), também foi verificada a concentração inibitória mínima (CIM) e a citotoxicidade. Os resultados mostraram que o método analítico de quantificação proposto foi capaz de quantificar simultaneamente 12 isoformas e séries homólogas de famílias lipopeptídeos em amostras biológicas. Com relação ao estudo de ampliação de escala, os resultados indicaram que a ampliação da carga de injeção pode ser realizada até 60 mg, em ambas as escalas. Comparando os resultados obtidos entre as escalas, notou-se que na escala preparativa o consumo de solvente foi 4 vezes maior (4,35 mL mg-1) quando comparado ao da escala semi-preparativa (1 mL mg-1), porém sua produtividade foi 2 vezes maior (0,0084 kg dia-1 kg-1), isso para a carga de 60 mg. Resultados satisfatórios foram apresentados pela partição líquido-líquido na obtenção individual da família de surfactina. O estudo da associação da HPLC com a partição líquido-líquido revelou que a associação é vantajosa quando se trabalha em escala preparativa e particionando, inicialmente, 20 mg do extrato bruto. Já os resultados da avaliação da atividade fungicida mostrou que a família de fengicina é ideal para o combate ao agente da fusariose, pois apresentou a menor CIM, com 0,0002 mg mL-1 e a família de surfactina para o combate ao agente da antracnose, pois apresentou a menor CIM, com 0,0003 mg mL-1. A baixa citotoxicidade das frações revela um resultado positivo para a aplicabilidade dos lipopeptídeos no controle de fitopatógenos, uma vez que, não afetaram as células humanas. Diante do exposto, pode-se concluir que o B. subtilis CNPMS 22 fornece um bio-recurso alternativo para o controle de fitopatógenos, pois os lipopeptídeos produzidos apresentam atividade antifúngica, podendo ser utilizados com um defensivo natural.
Abstract: The search for natural products capable of controlling phytopathogens is a growing need because of concern for both food safety and the environment. In this context, Bacillus subtilis stands out due to its potential in producing a large variety of lipopeptides with antifungal activity. Therefore, the general objective of the present work was to quantify, purify and verify the fungicidal action of the lipopeptides produced by the B. subtilis CNPMS 22. A lipopeptide quantification method was initially developed and validated in ultra-performance chromatography with a quadrupole detector ( UPLC-QDA) with the ion monitoring mode (SIM). SIM mode was used to detect and quantify lipopeptides exhibiting [M + H] + ions for iturins and surfacins and [M + 2H] 2+ for fengicins. The monitored ions were: m / z 1043.5; 1057.5; 1071.5; 718.3; 725.4; 739.4; 732.4; 746.4; 753.4; 1008.6; 1022.6 and 1036.6. The compounds were separated by reverse phase liquid chromatography using a C18 analytical column in a total time of 19 min. Later, a scale-up study of the fractionation of lipopeptide families using high-performance liquid chromatography (HPLC) was performed, both on the semi-preparative scale and the preparative scale. The use of the liquid-liquid partition in the separation of the compounds was also evaluated and the feasibility of partitioning with the HPLC was verified, both on a semi-preparative scale and on a preparative scale. For scaling tests with HPLC different loads were used (20, 40, 60 and 80 mg). In this stage the solvent consumption, productivity and yield were evaluated. In the partition was carried out tests of proportions of solvent aiming to determine the ideal condition for the separation of lipopeptides. Then, a study was carried out to evaluate the fungicidal activity of lipopeptide families and crude extract against Colletotrichum musae (anthracnose agent), Fusarium pallidoroseum (fusariosis agent) and Lasiodiplodia caatigensis (resting agent agent). minimum inhibitory concentration (MIC) and cytotoxicity were verified. The results showed that the proposed analytical method of quantification was able to simultaneously quantify 12 isoforms and homologous series of lipopeptide families in biological samples. Regarding the scaling-up study, the results indicated that the magnification of the injection load can be performed up to 60 mg, in both scales. Comparing the results obtained between the scales, it was observed that in the preparative scale the solvent consumption was 4 times higher (4.35 mL mg-1) when compared to the semi-preparative scale (1 mL mg-1). productivity was 2 times higher (0.0084 kg day-1 kg-1), this for the 60 mg load. Satisfactory results were presented by the liquid-liquid partition in the individual surfactin family. The study of the association of HPLC with the liquid-liquid partition revealed that the association is advantageous when working on a preparative scale and initially partitioning 20 mg of the crude extract. The results of the evaluation of the fungicidal activity showed that the fengicin family is ideal for combating the fusariosis agent, since it presented the lowest MIC with 0.0002 mg mL-1 and the surfactin family to combat the anthracnose agent , because it presented the lowest MIC, with 0.0003 mg mL-1. The low cytotoxicity of the fractions reveals a positive result for the applicability of the lipopeptides in the control of phytopathogens, since they did not affect the human cells. In view of the above, it can be concluded that B. subtilis CNPMS 22 provides an alternative bio-resource for the control of phytopathogens, since the lipopeptides produced have antifungal activity and can be used with a natural defensive agent.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/42040
metadata.dc.type: Tese
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