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Title in Portuguese: Quantificação por PCR em tempo real de Mycobacterium leprae em amostras de secreção nasal e biópsias de pele em hansenianos
Title: Real-time PCR quantification of Mycobacterium leprae in nasal and biopse skin samples from leprosy cases
Author: Marques, Lívia Érika Carlos
Advisor(s): Frota , Cristiane Cunha
Keywords: Hanseníase
Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real
Mucosa Nasal
Issue Date: 2013
Citation: MARQUES, L. E. C. Quantificação por PCR em tempo real de Mycobacterium leprae em amostras de secreção nasal e biópsias de pele em hansenianos. 2013. 72 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Faculdade de Medicina. Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013.
Abstract in Portuguese: O Mycobacterium leprae, agente etiológico da hanseníase, não é cultivável em meio axênico. A quantificação do bacilo realizada pelo exame baciloscópico e histopatológico é útil para a classificação da hanseníase na escolha e monitoramento do tratamento. No entanto, esta metodologia produz resultados de especificidade e sensibilidade limitada. A PCR em tempo real (qPCR) é um ensaio sensível e específico que permite a quantificação a partir de diversas amostras e pode ser utilizada no diagnóstico diferencial de muitos patógenos. Até o momento, nenhum estudo avaliou a sensibilidade e especificidade da qPCR para o diagnóstico da hanseníase utilizando amostras de secreção nasal. Portanto, este estudo teve como objetivo detectar e quantificar o DNA de M. leprae por qPCR em amostras de secreção nasal e biópsias de pacientes com hanseníase, correlacionando com a avaliação clínica e o índice baciloscópico. Foram analisadas 61 amostras de muco nasal e 19 amostras de biópsia de lesão de pele (pareadas) de casos confirmados de hanseníase atendidos no Centro de Referência Nacional em Dermatologia Sanitária Dona Libânia. Todas as amostras foram submetidas à extração e amplificação de DNA por nested PCR da região de 238 pb da sequência RLEP2. Posteriormente as amostras foram submetidas à quantificação da região 16S rRNA do genoma de M. leprae pela qPCR, cuja especificidade foi verificada através da curva de dissociação (Tm=79,5ºC). O método foi suficientemente sensível para detectar 20 fg de DNA de M. leprae, o equivalente a quatro bacilos. Na análise da secreção nasal, o ensaio foi capaz de confirmar o diagnóstico em 89,7% dos casos multibacilares (MB), e 73,3% dos casos paucibacilares (PB). A sensibilidade foi de 100% na analise de biópsias de pacientes MB. O número de bacilos detectados nas amostras de secreção nasal de pacientes com hanseníase se manteve no intervalo de 1,39 x 103 a 8,02 x 105 bacilos, enquanto a detecção em biópsia de pacientes MB variou de 1,87 x103 a 1,50 x 106. A PCR em tempo real é mais sensível do que a PCR convencional e pode ser utilizada como uma ferramenta complementar para o diagnóstico clínico e histopatológico da hanseníase.
Abstract: Mycobacterium leprae, the etiologic agent of leprosy, is not cultivable in axenic medium. The quantification of bacilli performed by skin bacilloscopy and histopathology is useful for the clinical classification of leprosy and treatment monitoring. However, this methodology yields low results regards to sensitivity and specificity. On the other way, the real-time quantitative PCR (qPCR) is a sensitive and specific assay that allows quantification of a varied of samples and also can be used for differential diagnosis of many pathogens. To this date, no studies have evaluated the sensitivity and specificity of qPCR for the diagnosis of leprosy from nasal secretion samples. Therefore, this study aimed at detecting and quantifying DNA from M. leprae by qPCR from nasal secretion and biopsy samples from leprosy cases, correlating with clinical and bacteriological index. We analyzed 61 samples of nasal secretion and 19 biopsy specimens of skin lesion (paired) from confirmed leprosy cases seen at the National Reference Center for Sanitary Dermatology Dona Libânia. All samples were subjected to DNA extraction followed by amplification by nested PCR of a region of 238 bp which targets a RLEP2 repetitive sequence. The samples were subjected to quantification of 16S rRNA region of the genome of M. leprae by qPCR, which specificity was verified by amplicon melting temperature (Tm = 79.5 ° C). The method was able to detect amounts over to 20 fg of M. leprae DNA, equivalent to four bacilli units. Nasal secretion assay was able to confirm the diagnosis in 89.7% of the multibacillary cases (MB) and 73.3% of the paucibacillary cases (PB). In addition, MB patient biopsies sensitivity was 100%. The number of bacilli detected in nasal secretion samples from leprosy patients ranged from 1.39 x 10³ to 8.02 x 105 bacilli, while detection in MB patient biopsy ranged from 1,87 x 103 to 1,50 x 106. The real-time PCR is more sensitive than conventional PCR and can be used as a complementary tool for the clinical and histopathological diagnosis of leprosy.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/4812
metadata.dc.type: Dissertação
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