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Title in Portuguese: Histoplasma capsulatum var. capsulatum : taxa de conversão in vitro, detecção do gene ryp1 e estudo da diversidade genética de cepas brasileiras
Title: Histoplasma capsulatum var. capsulatum : In vitro conversion, detection of ryp1 gene and study of variability genetic of brazilian strains
Author: Ribeiro, Joyce Fonteles
Advisor(s): Sidrim, José Júlio Costa
Keywords: Histoplasma
Epidemiologia Molecular
Conversão in vitro
Issue Date: 2012
Citation: RIBEIRO, J. F. Histoplasma capsulatum var. capsulatum : taxa de conversão in vitro, detecção do gene ryp1 e estudo da diversidade genética de cepas brasileiras. 2012. 115 f. Tese (Doutorado em Microbiologia Médica) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2012.
Abstract in Portuguese: A histoplasmose, causada pelo fungo dimórfico Histoplasma capsulatum, é a mais prevalente das micoses sistêmicas nas Américas, sendo frequentemente observada em pacientes com AIDS. Desde o início da epidemia de HIV, na década de 80, existe um aumento significativo no número de casos de histoplasmose no Estado do Ceará, Nordeste do Brasil. A escassez de dados epidemiológicos dos genótipos que circulam na região Nordeste ressalta a importância de estudos mais detalhados sobre a epidemiologia molecular de H. capsulatum nessa região. Diferentes técnicas moleculares têm sido utilizadas para melhor caracterizar o padrão genético de cepas de H. capsulatum circulantes no mundo. Vale ressaltar que, grande parte dos estudos de H. capsulatum é realizada na sua fase leveduriforme, quando expressa as suas características parasitárias. Assim, o uso de técnicas laboratoriais para a conversão in vitro para a fase leveduriforme e sua manutenção é extremamente importante. Diante do exposto, o presente estudo objetivou averiguar a taxa de conversão in vitro dos isolados de H. capsulatum em seis meios de cultura diferentes, bem como detectar, através da técnica de PCR, a presença do gene ryp1, um importante regulador transcricional da conversão da fase filamentosa para leveduriforme. Além disso, visou conhecer o perfil molecular de cepas de H. capsulatum, de origem humana e veterinária, oriundas do Estado do Ceará e da região Sudeste do Brasil, através da técnica de RAPD-PCR e avaliar a diversidade genética da região ITS1-5.8S-ITS2 desses isolados comparados com isolados de outros países, através do sequenciamento do DNA ribossômico nuclear. No estudo de conversão in vitro, todos os meios testados foram capazes de possibilitar a conversão de fases, contudo, o meio ágar Sabouraud suplementado com 10% de sangue de carneiro mostrou a maior capacidade de conversão em relação aos outros meios testados. O gene ryp1 foi detectado em 18 cepas de H. capsulatum (de origem humana e animal) e em três espécimes clínicos positivos para H. capsulatum (sangue total) testados, não sendo detectado, contudo, em isolados de Candida albicans, Paracoccidioides brasiliensis, Sporothrix schenckii e Coccidioides posadasii. A análise da variabilidade genética dos isolados de H. capsulatum, pela técnica de RAPD-PCR, permitiu a detecção de dois clusters que circulam no Estado do Ceará. O cluster 1 incluiu cepas das regiões Sudeste e Nordeste do Brasil, sendo observado dentro desse cluster a separação dos isolados em três subgrupos distintos (subgrupos 1a,1b e 1c). O cluster 2, por sua vez, incluiu somente cepas da região Nordeste do Brasil. Não foram observadas diferenças nas características clínicas e epidemiológicas dos indivíduos cujas cepas pertenciam aos diferentes agrupamentos, obtidos pela técnica de RAPD-PCR. O sequenciamento da região ITS1-5.8S-ITS2 possibilitou a detecção de dois clados principais. O clado 1 foi constituído da maioria das cepas analisadas, inclusive as cepas da região Nordeste e incluiu isolados de localizações geográficas distintas. O clado 2, por sua vez, foi constituído exclusivamente de isolados oriundos do Estado do Rio de Janeiro. Portanto, pode-se concluir que o ágar Sabouraud suplementado com 10% de sangue de carneiro apresentou maior capacidade de conversão das cepas de H. capsulatum em relação aos outros meios testados, podendo ser considerado o meio de escolha para conversão de cepas de H. capsulatum. Ademais, o gene ryp1 pode ser utilizado para identificar isolados de H. capsulatum, bem como, detectar a presença do fungo em amostras clínicas, podendo ser utilizado para diagnóstico de histoplasmose. Por fim, os isolados de H. capsulatum oriundos do Estado do Ceará podem ser agrupados em dois clusters principais, detectados através da técnica de RAPD-PCR. Além disso, a análise filogenética da região ITS1-5.8S-ITS2 revelou que as cepas da região Nordeste apresentaram diferenças genéticas quando comparadas com as cepas de outras regiões brasileiras, ficando agrupadas em um cluster diferente das mesmas.
Abstract: Histoplasmosis, caused by the dimorphic fungus Histoplasma capsulatum, is the most prevalent systemic mycosis in the Americas and it is frequently observed in AIDS patients. Since the beginning of the HIV epidemic, there has been a significant increase in the number of histoplasmosis cases in the Ceará state, Northeast Brazil. The lack of epidemiological data of the genotypes circulating in the Northeast region shows the importance of more detailed studies on the molecular epidemiology of H. capsulatum in this region. Different molecular techniques have been used to better characterize the genetic profile of H. capsulatum strains. It is noteworthy that, most studies of H. capsulatum are performed in the yeast phase due to its parasitic characteristics. Thus, the use of laboratory techniques for in vitro conversion and maintenance is extremely important. Given the above, this study aimed to determine the in vitro conversion rate of H. capsulatum isolates in six different culture media, as well as to detect by PCR the presence of ryp1 gene, an important transcriptional regulator of the conversion from filamentous to yeast phase. In addition, it aimed to establish the molecular profile of H. capsulatum strains, from human and veterinary source, from Ceará and Southeast region of Brazil through RAPD-PCR assay and to assess the genetic diversity of the ITS1-5.8S-ITS2 region of these isolates compared with isolates from other countries, through the sequencing of nuclear ribosomal DNA. In the study of in vitro conversion, all tested media allowed the conversion, however, the Sabouraud agar media supplemented with 10% sheep blood showed the highest conversion capacity in relation to the other tested media. The ryp1 gene was detected in 18 H. capsulatum strains (from human and animal source) and in three tested clinical specimens (whole blood), not being detected, however, in isolates of Candida albicans, Paracoccidioides brasiliensis, Sporothrix schenckii and Coccidioides posadasii. The analysis of the genetic variability of the H. capsulatum isolates, by RAPD-PCR assay, allowed the detection of two clusters circulating in the state of Ceará. The first cluster included strains from Southeast and Northeast regions of Brazil, being observed, within this cluster, the separation of isolates into three distinct subgroups (subgroups 1a, 1b and 1c). The second cluster included only strains from Northeast region of Brazil. There were no differences in clinical and epidemiological characteristics of individuals whose isolates belonged to different groups, obtained by RAPD-PCR. The sequencing of the ITS1-5, 8S-ITS2 region allowed the detection of two major clades. The clade 1 comprised the majority of the isolates tested, including strains from the Northeast, and included isolates from different geographical locations. The clade 2 was composed exclusively of isolates from the state of Rio de Janeiro. Therefore, it can be concluded that the Sabouraud agar supplemented with 10% sheep blood showed higher conversion capacity of H. capsulatum strains compared to the other tested media, and may be considered the medium of choice for converting of H. capsulatum strains. Furthermore, the ryp1 gene can be used to identify and detect H. capsulatum from clinical specimens, may be used for diagnosis of histoplasmosis. Finally, the H. capsulatum isolates from the state of Ceará can be grouped into two main clusters, detected by RAPD-PCR. In addition, phylogenetic analysis of the ITS1-5.8S-ITS2 region revealed that strains from the Northeast presented genetic differences compared with strains from other Brazilian regions, being grouped in a different cluster of them.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/4825
metadata.dc.type: Tese
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