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Title in Portuguese: Efeito tripanocida dos ácidos betulínico e oleanóico
Author: Sousa, Paloma Leão
Advisor(s): Martins, Alice Maria Costa
Keywords: Trypanosoma cruzi
Terpenos
Necrose
Autofagia
Apoptose
Issue Date: 2017
Citation: SOUSA, P. L. Efeito tripanocida dos ácidos betulínico e oleanóico. 2017. 90 f. Tese (Doutorado em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017.
Abstract in Portuguese: A doença de Chagas é uma doença negligenciada causada pelo parasito Trypanosoma cruzi e constitui um problema de saúde pública em todo o mundo. O tratamento a tual é restrito pelos efeitos colaterias frequentes e pela eficácia limitada do benzonidazol. O ácido betulínico (A B e ácido oleanólico (AO) AO), são triterpenos, exist ntes em diversas plantas medicinais e exibem uma grande variedade de atividades biológicas e farmacológicas , incluindo efeito em tripanossomatídeos. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito tripanocida e mecanismo de ação dos ácidos betulínico e oleanólico em cepa Y de Trypanosoma cruzi in vitro . O efeito tripanocida do AB e AO (1,56 200 μM) foram avaliadas durante 24, 48 e 72 horas, sob formas epimastigotas, tripomastigotas e amastigotas de T. cruzi. A viabilidade da célula LLCMK2, tratada com AB e AO (200 1600 μM) fo i avaliada durante 24h através do teste MTT. Os ensaios de mecanismo de ação foram realizados nas formas ep imastigotas tratadas com CI50 do AB e AO durante 24 h , e marcadas com ane xina V/7AAD, Rho123, H2DCFDA, Laranja de Acridina e MDC de acordo com as instruções do fabricante e analisadas por citometria de fluxo e microscopia confocal . Os dados foram analisados utilizando ANOVA com pós teste de Bonferroni ou teste t Student , * p≤0,05. O AB inibiu o crescimento de formas epimastigotas em 24h (CI50 = 73,43 BZ = 2 18 μM), 48h (CI50 = 119,8 μM; BZ = 61 μ M ) e 72h (CI50 = 212,2 μM; BZ = 16,5 μ M ) de incubação; inibiu a viabilidade de t ripomastigotas (CI50 = 51,88 μ M; BZ = 257 μ M ) em 24h. O AO inibiu o crescimento de epimastigotas em 24h (CI50 = 11,66 μM; BZ = 218 μM ), 48h (CI50 = 43,15 μM; BZ = 61 μ M ) e 72h (CI50 = 43,05 μM; BZ = 16,5 μ M ) de incubação; inibiu a viabilidade de tripomastigotas (IC50 = 13,97 μM; BZ = 257 μ M ) em 24h. O AB e AO diminuiram o percentual de células infectadas e reduziram o número de amastigotas por células nos tratamentos com 24h e 48 h, respectivamente. Ambos terpenos não apresentaram toxicidade sobre as células LLCMK2 n as concentrações utili zadas . A análise do mecani smo de morte celular do parasito tratado com AB mostrou alterações no potencial da membrana mitocondrial, alterações na integridade da membrana celular, aumento da formação de espécies reativas de oxigênio e detecção de compartime ntos acídico s . O tratamento com AO demonstrou detecção de compartimentos acídico s e de vacuólos autofágicos Nossos resultados demonstram que o AB e AO apresentam efeito tripanocida sobre todas as formas evolutivas de cepa Y de T. cruzi , sugerindo que o me canismo de morte celular do AB é via necrose e do AO via autofagi c a nas formas epimastigotas.
Abstract: Chagas disease is a neglected disease caused by the parasite Trypanosoma c ruzi and is a public health problem world wide . Current treatment is restricted by the frequent side effects and limited efficacy of benznidazole . Betulinic acid (BA) and oleanolic acid (OA) are triterpenes found in several medicinal plants and exhibit a wi de variety of biological and pharmacological activities, including an effect on trypanosomatids. The objective of the present study was to evaluate the trypanocidal effect and mechanism of action of betulinic and oleanolic acids on Trypanosoma cruzi strain Y in vitro . Antiproliferative activity of BA and OA (1.56 200  M) were evaluated during 24, 48 and 72 hours on epimastigote, trypomastigote and amastigote forms of T. cruzi . Viability of LLCMK2 cell s , treated with BA and OA (200 1600  M), was evaluated for 24 h using the MTT assay. The mechanism of action assays were performed on the epimastigote form s treated with IC50 of BA and OA, incubated for 24 h, then labeled with annexin V/7AAD, Rho123, H2DCFDA, Acridine Orange and MDC according to the manufacturer's instructions and analyzed by flow cytometry and confocal mic roscopy. Data were analyzed using ANOVA with Bonferroni post test or Student ’s t test, * p 0.05. BA inhibited the growth of epimastigotes after 24h (I C 50 = 73.43  M; BZ = 21 8  M), 48h (I C 50 = 119.8  M; BZ = 61  M) and 72h (I C 50 = 212 2  M; BZ = 16.5  M) of incubation and i nhibited the viability of trypomastig otes (I C 50 = 51 88  M; BZ = 257  M) after 24 h. OA inhibited the growth of epimastigote s after 24 h (IC50 = 11.66  M, BZ = 218  M), 48 h (IC50 = 43.15  M, BZ = 61  M), and 72 h IC50 = 43.05  M; BZ = 16.5  M ) of incubation and i n hibited the viability of trypomastigotes (IC50 = 13.97 μ M; BZ = 257  M) after 24 h. BA and OA decreased the percentage of infected cells and reduced the number of amastigotes per cell 24h and 48h after treatments, respectively. Both terpenes showed no toxicity on LLCMK2 cells at the concentrations used in trypanocidal tests. The analysis of cell death mechanism of the BA treated parasite s showed alterations in mitochondrial membrane potential, changes in cell membrane integrity, increased formation of reactive oxygen species and detection of acidic compartments. The treatment with OA demonstrated the detection of acidic compartments and autophagic vacuoles. Our results demonstrate that BA and OA have a trypanocidal effect on all evolutionary forms of T. cruzi Y strain, suggesting that the BA mechanism of cell death occurs through necrosis and that of the OA through autophagy in epimastigote forms.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/50399
metadata.dc.type: Tese
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