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Title in Portuguese: Uso de plantas como biorreatores para a produção heteróloga da proteína NS2B do Zika vírus como insumo para diagnóstico
Title: Use of plants as bioreactors for the heterologous production of the NS2B protein of the Zika virus as a diagnostic input
Author: Herazo, Mario Alberto Maestre
Advisor(s): Moura, Arlindo de Alencar Araripe Noronha
Keywords: Vírus Zika
Proteínas recombinantes
Expressão transitória
Diagnóstico
Issue Date: 2020
Citation: HERAZO, Mario Alberto Maestre. Uso de plantas como biorreatores para a produção heteróloga da proteína NS2B do Zika vírus como insumo para diagnóstico. 2020. 108 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia) - Universidade Federal do Ceará. Fortaleza. 2020.
Abstract in Portuguese: O Zika é uma doença infecciosa emergente causada pelo vírus zika (ZIKV), e está relacionada a distúrbios neurológicos como microcefalia e síndrome de Guillain-Barré. A detecção e diferenciação do ZIKV frente a outros arbovivírus semelhantes é baseada principalmente em métodos moleculares (RT-PCR e testes sorológicos). Entretanto, testes sorológicos tem sido um problema devido a reações cruzadas principalmente em amostras de soro. Muitas proteínas usadas no diagnóstico sorológico de doença são produzidas de forma recombinante principalmente em plataforma procariota. Contudo, o uso de plantas para a expressão de proteínas recombinantes para fins diagnósticos tornou-se uma alternativa promissora por ser econômica, segura e rápida em comparação com outras plataformas. O objetivo deste trabalho foi expressar uma proteína não estrutural do ZIKV, NS2B, em plataforma vegetal para fins de diagnóstico. Para isso, o gene da proteína NS2B foi fusinado a uma cauda de Hidrofobina I (HFBI) e expresso transitoriamente em plantas de Nicotiana benthamiana utilizando como vetor a Agrobacterium tumefaciens. A detecção da NS2B::HFBI em extratos das folhas infiltradas foi realizada por meio de western blot (WB) usando anticorpo anti-c-myc, presente no construto e, posteriormente purificada através de separação aquosa em duas fases (ATPS), seguido por cromatografia de interação hidrofóbica. Após a purificação, a proteína recombinante teve sua antigenicidade avaliada por WB usando anticorpo específico comercial e soros de paciente positivos para ZIKV. Testes de ELISA- IgM para soros de pacientes positivos para dengue ou Zika também foram realizados, apresentando sensibilidade de 95,0% e 100% de especificidade para diagnóstico do ZIKV. A imunização de camundongo por via subcutânea com a proteína recombinante foi capaz de induzir resposta imunológica, gerando anticorpos que, após purificação, foram utilizados para a detecção da proteína viral em soro de pacientes com ZIKV. Com base nos resultados obtidos, este trabalho mostrou que o processo expressão transiente de NS2B em plataforma vegetal tem alto potencial na produção de insumos para o diagnóstico de ZIKV.
Abstract: Zika is an emerging infectious disease caused by the Zika virus (ZIKV), and it is related to neurological disorders such as microcephaly and Guillain-Barré syndrome. The detection and differentiation of ZIKV from other similar arboviviruses is based mainly on molecular methods (RT-PCR and serological tests). However, this has been a problem due to cross- reactions mainly in serum samples. Many proteins used in the serological diagnosis of the disease are produced recombinantly, mainly on a prokaryotic platform. However, the use of plants for the expression of recombinant proteins for diagnostic purposes has become a promising alternative because it is economical, safe and fast compared to other platforms. The objective of this work was to evaluate the possibility of expressing the non-structural protein from ZIKV, NS2B, on a plant platform to be used for diagnostic purposes. Therefore, the NS2B protein gene was fused with a Hydrophobin I (HFBI) tag and expressed transiently in Nicotiana benthamiana plants using Agrobacterium tumefaciens as a vector. The detection of NS2B::HFBI in extracts of infiltrated leaves was done using western blot technic and an anti-c-myc antibody, subsequently the protein was purified through aqueous two-phase separation (ATPS), followed by hydrophobic interaction chromatography. After purification, the recombinant protein had its antigenicity assessed by WB using a commercially specific antibody and sera from ZIKV + patient. ELISA-IgM tests for dengue and Zika of patients with positive sera were also performed, with a sensitivity of 95.0% and 100% specificity for ZIKV. In subcutaneous mouse immunization tests, a recombinant protein was able to induce an immune response, generating antibodies that, after purified was used for the detection of viral protein in the serum of ZIKV patients. Based on the obtained results, this work showed that the plant produced NS2B has high potential in the diagnostics kits for ZIKV.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/53360
metadata.dc.type: Tese
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