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Title in Portuguese: Vipericidinas e derivados: caracterização de alvo molecular em Trypanosoma cruzi, avaliação antiparasitária e antitumoral, visando o uso biotecnológico dos peptídeos terapêuticos.
Title: Vipericidins and derivatives: characterization of molecular target in Trypanosoma cruzi, antiparasitic and antitumor evaluation, aiming at the biotechnological use of therapeutic peptides.
Author: Rêgo, Juciane Vaz
Advisor(s): Baptista, Gandhi Rádis
Keywords: Peptídeos antimicrobianos
Vipericidinas
Ciclofilina A (TcCyP19)
Trypanosoma cruzi
Peixe zebra
Células tumorais
Citotoxicidade
Issue Date: 2014
Citation: RÊGO, Juciane Vaz. Vipericidinas e derivados: caracterização de alvo molecular em Trypanosoma cruzi, avaliação antiparasitária e antitumoral, visando o uso biotecnológico dos peptídeos terapêuticos. 2014. 153 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014
Abstract in Portuguese: Os peptídeos antimicrobianos relacionados com as catelicidinas- as vipericidinas estão envolvidos na resposta imune inata, no sistema de defesa de muitos organismos, tendo um modo rápido de ação, podendo assim atuar em conjunto com esquemas terapêuticos existentes e/ou constituírem uma alternativa aos fármacos antibióticos convencionais. O presente estudo de tese tem como objetivos duas vertentes: a primeira caracterizar o gene alvo de T cruzi, que interage in silico com as vipericidinas: a Ciclofilina-A (TcCyP19) em populações sensíveis e resistentes do T.cruzi ao Benzonidazol; segunda avaliar in vitro a atividade antiparasitária e a antitumoral, bem como avaliar a citotoxicidade das vipericidinas e seus derivados, visando o uso biotecnológico desses peptídeos. Estudo in silico permitiu identificar uma ciclofilina que interage com o peptídeo antimicrobiano GA650- (lutzicidina) do veneno de jararacas. Esse achado é de interesse particular visto que nosso grupo de pesquisa havia realizado um estudo proteômico identificando a ciclofilina-A como uma proteína superexpressa (10 x) em populações resistentes do T. cruzi comparado com seu par sensível ao benzonidazol. Diante disso a Ciclofilina-A (TcCyP19), uma peptidil prolil isomerase - molécula-chave com diversas funções biológicas, que incluem dobramento molecular, resposta ao stress, a modulação imunitária e transdução de sinal - compreende um potencial alvo de fármaco, e portanto foi selecionada para estudo. A análise filogenética revelou uma clara divergência entre as seqüências Ciclofilinas-A de tripanosomatídeos e mamíferos – o que a torna uma alvo diferencial. Uma combinação das análises de Southern blot e tempo real de RT-PCR ( qPCR ) mostraram que TcCyP19 é um gene de cópia única localizada em bandas cromossômicas que variam em tamanho de 0,68-2,2 Mb, dependendo da cepa de T. cruzi. Northern blot e qPCR indicaram que os níveis de mRNA TcCyP19 eram duas vezes maior em populações de T. cruzi resistentes a fármacos do que contrapartida de seu par sensível. Do mesmo modo , a expressão da proteína CyP19, conforme determinado por electroforese em gel bidimensional / western blot, foi aumentada na mesma ordem em populações resistentes do T.cruzi ao BZ. Essas cepas foram usadas para avaliação da atividade antiparasitária das vipericidinas. Além da atividade antiparasitária, nosso grupo determinou a ação inibitória das vipericidinas contra bactérias e fungos. Ensaio de atividade anti-T.cruzi in vitro de formas epimastigotas, tripomastigotas e amastigotas intracelulares, foi observado que a Vipericidina (crotalicidina – peptídeo C1AB) teve efeito citotóxico dose-dependente contra epimastigotas de T.cruzi (IC50 24h = 4.72 µM; IC50 48h = 4.37 µM). Para formas tripomastigotas e amastigotas intracelulares somente as vipericidinas -crotalicidina teve atividade seguindo de citotoxicidade celular e nas demais amostras foram inativas. Para avaliação a ação anticancerígena neste estudo, identificamos um oligopeptídeo de nove resíduos, KRFKKFFKK (EVP50) que é repetidamente codificado em conjunto dentro de seqüências da vipericidina. EVP50 exibiu ademais uma potente toxicidade letal para peixe-zebra (Danio rerio) (LD = 10 µM), somente quando o N-terminal do peptídeo foi quimicamente conjugado com rodamina B (RhoB). In vitro, a RhoB conjugado EVP50 exibiu um efeito antitumoral dependente da concentração, em relação às células MCF-7 de câncer da mama. Nas células MCF-7, o nonapeptídeo EVP50 RhoB conjugado se acumulou no citoplasma e núcleo dentro de minutos. No citoplasma, o RhoB-EVP50 induziu influxo de cálcio extracelular, liberação de cálcio intracelular e lesões da membrana após a incubação com concentrações micromolares do EVP50 conjugado com o composto fluorescente. O peptídeo não conjugado foi desprovido de atividades tóxico e citotóxico em nossos modelos in vivo e in vitro. Assim, a interferência do conjugado com a homeostase do cálcio, sua função nuclear e sua disfunção membrana induzida (lesão e vacuolização) parecem agir em conjunto para romper o circuito da célula. Este mecanismo sinérgico da toxicidade foi restrita ao nonapeptídeo vipericidina estruturalmente modificado. Como um todo, o presente estudo vem contribuir para o entendimento do alvo molecular (Ciclofilina-A) que interage com peptídeo vipericidina e como potencial dessa classe de peptídeos em biotecnologia médica contra T. cruzi e atividade anticancerígena, quando o peptídeo é conjugado.
Abstract: Antimicrobial peptides related cathelicidins-vipericidins are involved in the innate immune response in the defense system of many organisms, and a mode of action rapid, and thus can operate in conjunction with existing and / or regimens constitute an alternative to conventional antibiotics drugs. The present study of thesis has as goals two aspects: first to characterize the target gene of T.cruzi, which interacts in silico with the vipericidin: Cyclophilin A (TcCyP19) in sensitive and resistant strains of Trypanosoma cruzi to benznidazole; second to evaluate in vitro antiparasitic and antitumor activity, as well as evaluate the cytotoxicity of vipericidinas and its derivatives, aiming at the use biotechnological of these peptides. In silico study allowed identifying a cyclophilin that interacts with the antimicrobial peptide GA650- (lutzicidina) from the venom of pit vipers. This finding is of particular interest given that our research group had conducted one study proteomic identifying the cyclophilin-A as an overexpressed protein (10 x) in resistant populations of T. cruzi compared with their pair-sensitive benznidazole. Therefore Cyclophilin A (TcCyP19), a peptidyl - prolyl isomerase - key molecule with diverse biological functions, including molecular folding, stress response, immune modulation and signal transduction - comprises a potential drug target, and thus was selected for study. Phylogenetic analysis revealed a clear divergence between the sequences of Cyclophilin-A trypanosomatids and mammals - which makes it a differential target. A combination of the Southern blot analysis and real-time RT-PCR (qPCR) showed that TcCyP19 is a single copy gene located in the chromosomal bands ranging in size from 0.68 to 2.2 Mb, depending on the strain T. cruzi. Northern blot and qPCR indicated that mRNA levels TcCyP19 were twice higher in populations of T. cruzi BZ resistant than its sensitive counterpart pair. Similarly, the expression of CyP19 protein, as determined by two-dimensional electrophoresis / western blot gel was increased in the order of resistant populations T.cruzi to BZ. Altogether, these data indicate that Cyclophilin A (TcCyP19) expression is up-regulated at transcriptional and translational levels in T. cruzi populations which were in vitro-induced and in-vivo selected for resistance to BZ. These strains were used to evaluate the antiparasitic activity of vipericidinas. Besides the antiparasitic activity, our group determined the inhibitory action of vipericidinas against bacteria and fungi. Activity assay in vitro anti-Trypanosoma cruzi epimastigotes, trypomastigote and intracellular amastigotes, it was observed that Vipericidin (crotalicidin – GA645 peptide) had dose-dependent cytotoxic effect against epimastigotes of Trypanosoma cruzi (24h IC50 = 4.72 uM; IC50 48h = 4:37 mM). To trypomastigotes and intracellular amastigotes only had activity of crotalicidin vipericidin following cell cytotoxicity and the remaining samples were inactive. For trypomastigote and amastigote forms only vipericidin GA645-crotalicidin have activity followed by cell cytotoxicity and the other samples were inactive. For to evaluate anticancer action in this study, we identify a nine-residue cryptic oligopeptide, KRFKKFFKK (EVP50) that is repeatedly encoded in tandem within vipericidin sequences. EVP50 addition exhibited a potent lethal toxicity to zebrafish (Danio rerio) (DL = 10 mM), only when the N-terminal peptide was chemically conjugated to rhodamine B (RhoB). In vitro, RhoB-conjugated EVP50 exhibits a concentration-dependent antitumor effect toward MCF-7 breast cancer cells. In MCF-7 cells, the RhoB-conjugated EVP50 nonapeptide accumulated in the cytoplasm and the nucleus within minutes. In the cytoplasm, the EVP50 RhoB-induced influx of extracellular calcium, intracellular calcium release and membrane lesions after incubation with micromolar concentrations of EVP50 conjugated with the fluorescent compound. The naïve unconjugated peptide was devoid of toxic and cytotoxic activities in our models in vivo and in vitro. Thus, the conjugate’s interference with calcium homeostasis, its nuclear function and its induced membrane dysfunction (lesion and vacuolization) seem to act in concert to break the cell circuitry. This synergistic mechanism of toxicity was restricted to structurally modified vipericidin nonapeptide. As a whole, this study contributes to the understanding of the molecular target (cyclophilin-A) that interacts with vipericidin peptide and a potential of this class of peptides in medical biotechnology against T. cruzi and anticancer activity when the peptide is conjugated.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/57064
metadata.dc.type: Tese
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