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Title in Portuguese: Estratégias para obtenção da enzima recombinante L-arabinose isomerase (L-AI) por expressão heteróloga em Escherichia coli BL21 (DE3) através do método de autoindução.
Title: Strategies for obtaining the recombinant enzyme L-arabinose isomerase (L-AI) by heterologous expression in Escherichia coli BL21 (DE3) using the autoinduction method.
Author: Souza, Ticiane Cavalcante de
Advisor(s): Gonçalves, Luciana Rocha Barros
Co-advisor(s): Hissa, Denise Cavalcante
Keywords: L-arabinose isomerase.
D-tagatose.
Autoindução.
Lactose.
Soro de leite.
Issue Date: 2020
Citation: SOUZA, Ticiane Cavalcante de. Estratégias para obtenção da enzima recombinante L-arabinose isomerase (L-AI) por expressão heteróloga em Escherichia coli BL21 (DE3) através do método de autoindução. 2020. 137 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia)-Universidade Federal do Ceará. Fortaleza. 2020.
Abstract in Portuguese: A busca constante por mudanças nos hábitos alimentares levou à geração de produtos que agregam benefícios à saúde de quem os consome, apresentando vantagens de caráter fisiológico quando relacionados aos produtos disponíveis no mercado. Dentre esses produtos, a D-tagatose surge como um promissor substituto da sacarose, apresentando 90% de doçura e baixo valor calórico (1,5 kcal. g-1), quando comparada ao açúcar comum (4,0 kcal. g-1). Esse edulcorante é pouco absorvido pelo organismo, não eleva as taxas de açúcar no sangue, apresenta propriedades prebióticas, antioxidantes e antidiabéticas. Uma das formas de obtenção da D-tagatose é através da isomerização da D-galactose, catalisada pela enzima L-arabinose isomerase (L-AI). Esse estudo avalia as diferentes estratégias para a obtenção da enzima recombinante L-AI de Enterococcus faecium DBFIQ E36 em E. coli, visando a substituição do método de indução, com emprego de 0,5mM de Isopropil β-1-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) pelo método de autoindução, voltando-se para possibilitar sua disponibilidade à nível comercial. Para o processo de obtenção da proteína recombinante, foram empregados glicose e glicerol, como fontes de carbono, lactose (comercial) e lactose proveniente de soro de leite, como agentes de indução, nas concentrações de 2 e 4g.L-1. O soro de leite é considerado um subproduto da indústria de laticínios e tem se destacado como uma promissora matéria-prima aplicada em processos biotecnológicos. Os cultivos pelo método de autoindução, além de serem considerados de baixo custo, não apresentam citotoxidade e não é necessário monitoramento do processo para adição da lactose, uma vez que as bactérias realizam a seleção das fontes de carbono e do indutor, disponíveis no meio. Os extratos de L-AI alcançaram atividades catalíticas de 1,67 ± 0,14 U. mL-1 e 0,7 ± 0,04 U. mL-1, quando produzidos com uso da lactose comercial e IPTG, respectivamente. Os extratos induzidos com a lactose derivada do soro de leite apresentaram atividade catalítica de 3,8 U. mL-1. Avaliando o aumento de escala, a expressão da enzima com uso da lactose comercial, em biorreator, a 300 rpm, com volume útil de 3L e fluxo de transferência de oxigênio de 0,6 L.min-1, apresentou sua máxima atividade enzimática com 8h de cultivo (2,7 ± 0,01 U.mL-1). A L-AI exibiu as melhores atividades catalíticas a 50°C, pH 5,6 e maior bioconversão da reação de isomerização da D-galactose em D-tagatose, quando a reação ocorreu com uso de 500 mM de D-galactose, atingindo uma concentração de 97,7 mM e rendimento de 20%, após 28h. Assim, este estudo apresentou protocolos promissores e inovadores para a expressão efetiva da proteína recombinante, através dos métodos de autoindução, com emprego da lactose comercial e lactose procedente do soro de leite.
Abstract: The constant changes in eating habits led to the generation of products that add health benefits to those who consume them, as improvements of a physiological nature when related to the products available on the market. Among these products, D-tagatose appears as a promising substitute for sucrose, presenting 90% sweetness and low caloric value (1.5 kcal. g-1), when compared to common sugar (4.0 kcal. g-1). This sweetener is poorly absorbed by the body, does not raise blood sugar levels, and has prebiotic, antioxidant and anti-diabetic properties. One of the ways to obtain D-tagatose is through the isomerization of D-galactose catalyzed by the enzyme L-arabinose isomerase (L-AI). This study evaluates different strategies for obtaining the recombinant enzyme L-AI from Enterococcus faecium DBFIQ E36 in E. coli aiming to replace the induction method, which uses 0.5 mM of Isopropyl β-1-D-thiogalactopyranoside (IPTG) by the auto-induction method, aspiring to enable its availability at commercial level. For the process of obtaining the recombinant protein, glucose and glycerol were used as carbon sources, lactose (commercial) and lactose from whey as induction agents at concentrations of 2 and 4 g.L-1. Whey is considered a by-product of dairy industry and has stood out as a promising raw material applied in biotechnological processes. Cultivations by the auto-induction method are considered low cost, do not present cytotoxicity and since the bacteria select the sources of carbon and the inducer available in the medium, there is no need to monitor the process for adding lactose. The L-AI extracts achieved catalytic activities of 1.67 ± 0.14 U. mL-1 and 0.7 ± 0.04 U. mL-1, when produced using commercial lactose and IPTG, respectively. The extracts induced with lactose derived from whey showed catalytic activity of 3.8 U. mL-1. Evaluating the scale increase, the expression of the enzyme using commercial lactose in a bioreactor at 300 rpm with a useful volume of 3L and an oxygen transfer flow of 0.6 L.min-1, showed its maximum enzymatic activity with 8h of culture (2.7 ± 0.01 U.mL-1). L-AI exhibited the best catalytic activities at 50 °C, pH 5.6 and greater bioconversion of D-galactose isomerization reaction to D-tagatose when reaction occurred using 500 mM D-galactose reaching a concentration of 97.7 mM and 20% yield, after 28h. Thus, this study presented promising and innovative protocols for the effective expression of recombinant protein through auto-induction methods using commercial lactose and lactose from whey.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/57523
metadata.dc.type: Tese
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