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Title in Portuguese: Análise in vitro, in silico e in vivo dos efeitos antinociceptivos e anti-inflamatórios de dois triterpenos semissintéticos (CL-P2 e CL-P2A)
Title: In vitro, in silico and in vivo analysis of antinociceptive and anti-inflammatory effects of two semisynthetic triterpens (CL-P2 e CL-P2A)
Author: Passos, Maria Juliane
Advisor(s): Brayner, Mirna Marques Bezerra
Keywords: Bioinformática
Combretum leprosum
Dor inflamatória
Nocicepção
Toxicidade
Issue Date: 2020
Citation: PASSOS, Maria Juliane. Análise in vitro, in silico e in vivo dos efeitos antinociceptivos e anti-inflamatórios de dois triterpenos semissintéticos (CL-P2 e CL-P2A). 2020. 156 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia) - Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2020.
Abstract in Portuguese: Compostos semissintéticos obtidos a partir de produtos naturais isolados de plantas podem representar ferramentas farmacológicas intressantes na bioprospecção de novos fármacos para o controle da dor inflamatória. Combretum leprosum é uma espécie encontrada no Norte e Nordeste brasileiros sendo usada pela comunidade como agente anti-inflamatório. Dentre suas substâncias isoladas destaca-se o triterpeno 3β,6β,16β-tri-hidroxilup-20(29)-eno (CL-1), obtido das flores do Combretum leprosum Mart, que possui diversas atividades biológicas. O objetivo desse estudo foi realizar a análise in vitro, in silico e in vivo da atividade de dois triterpenos semissintéticos (CL-P2 e CL-P2A) derivados de CL-1. Os ensaios in vitro incluíram os testes de citotoxicidade em fibroblastos murinos (L929) e queratinócitos humanos (HaCaT) pelo método de coloração com sulforodamina B (SRB) após 24h, 48h e 72h. Para os ensaios in silico CL-P2 e CL-P2A foram desenhadas no programa MarvinSketch, para a obtenção do código SMILES (Simplified Molecular Input Line Entry Specification). A partir desse código obteve-se suas propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas. Para os ensaios in vivo foram usados 120 camundongos Swiss machos (25-30g). A atividade in vivo de CL-P2 (0,1; 1 ou 10 mg/kg) ou CL-P2A (0,1; 1 ou 10 mg/kg) foi analisada por meio do teste de contorção abdominal induzida por zymosan. Investigou-se o mecanismo de ação de CL-P2 ou CL-P2A através da dosagem da atividade das enzimas mieloperoxidase (MPO) e Superóxido Dismutase (SOD) além dos níveis de nitrito/nitrato. Para os ensaios de toxicidade aguda e subaguda, grupos foram tratados (per os) diariamente com a maior dose efetiva de CL-P2 ou CL-P2A (10 mg/kg) durante 14 dias. Os resultados foram expressos como média ± EPM e considerou-se p<0,05 como significativo. Os resultados in vitro demonstraram que CL-P2 e CL-P2A apresentaram baixa citotoxicidade nas linhagens celulares testadas, no entanto, nas concentrações mais elevadas (20 e 40 μg/mL), ambos os compostos reduziram o crescimento celular, apresentando efeito citostático. As análises in silico sugeriram que as enzimas cicloxigenases 1 e 2 (COX-1 e COX-2) podem ser alvos de CL-P2, enquanto que o receptor mu do tipo 1 poderia ser um alvo para CL-P2A. No modelo de contorção abdominal induzida por zymosan, tanto CL-P2 (1 ou 10 mg/kg) (16,67±2,17 e 9,16±2,93, respectivamente) quanto CL-P2A (1 ou 10 mg/kg) (3,57 ±1,17 e 4,83±0,70, respectivamente) reduziu o número de contorções, quando comparado ao grupo não-tratado (33,50±6,18). Investigando o mecanismo de ação observou-se que nenhum dos compostos CL-P2 (10 mg/kg) ou CL-P2A (10 mg/kg) - reduziu o influxo de neutrófilos para a cavidade peritoneal, avaliado indiretamente pela atividade de MPO (3,39±0,83 e 3,68 ±0,29, respectivamente), quando comparado ao grupo não-tratado (3,32±0,29); no entanto, o efeito antinociceptivo de CL-P2 foi associado com redução dos níveis de nitrito/nitrato (0,607±0,009), enquanto que o efeito antinociceptivo de CL-P2A foi associado com o aumento da atividade de SOD (2,242±0,113), quando comparado ao grupo não tratado (nitrito 0,66 ±0,01 e da SOD 1,683±0,008),respectivamente). Os ensaios de toxicidade aguda e subaguda não revelaram evidência de alterações, quando comparado ao grupo não tratado. CL-P2 e CL-P2A, atuando por diferentes mecanismos de ação, reduzem a dor inflamatária e parecem seguros quando administrados a camundongos durante 14 dias,sugerindo a eficácia e a segurança pré-clínica de CL-P2 e CL-P2A. Ainda, considerando que seus alvos farmacológicos teóricos estão associados com a modulação da dor inflamatária, esses dados podem subsisdiar a bioprospecção de novos fármacos no controle desses eventos.
Abstract: Semi-synthetic compounds obtained from natural products isolated from plants may represent interesting pharmacological tools in the bioprospecting of new drugs for the control of inflammatory pain. Combretum leprosum is a species found in the North and Northeast of Brazil and is used by the community as an anti-inflammatory agent. Among its isolated substances, triterpene 3β, 6β, 16β-tri-hydroxilup-20 (29) -ene (CL-1), obtained from the flowers of Combretum leprosum Mart, which has several biological activities. The aim of this study was to perform the in vitro, in silico and in vivo analysis of the activity of two semi-synthetic triterpenes (CL-P2 and CL-P2A) derived from CL-1. In vitro assays included cytotoxicity tests on murine fibroblasts (L929) and human keratinocytes (HaCaT) using the sulforodamine B staining method (SRB) after 24h, 48h and 72h. For the in silico tests CL-P2 and CL-P2A, they were designed in the MarvinSketch program, to obtain the SMILES code (Simplified Molecular Input Line Entry Specification). From this code, its pharmacokinetic and pharmacodynamic properties were obtained. For in vivo assays, 120 male Swiss mice (25-30g) were used. The in vivo activity of CL-P2 (0.1; 1 or 10 mg / kg) or CL-P2A (0.1; 1 or 10 mg / kg) was analyzed using the zymosan-induced abdominal contortion test. The mechanism of action of CL-P2 or CL-P2A was investigated by measuring the activity of myeloperoxidase (MPO) and Superoxide Dismutase (SOD) in addition to nitrite / nitrate levels. For acute and subacute toxicity tests, groups were treated (per os) daily with the highest effective dose of CL-P2 or CL-P2A (10 mg / kg) for 14 days. The results were expressed as mean ± SEM and p <0.05 was considered significant. The in vitro results demonstrated that CL-P2 and CL-P2A showed low cytotoxicity in the tested cell lines, however, at the highest concentrations (20 and 40 μg / mL), both compounds reduced cell growth, showing a cytostatic effect. In silico analyzes suggested that the enzymes cyclooxygenases 1 and 2 (COX-1 and COX-2) may be targets for CL-P2, whereas the mu-type 1 receptor could be a target for CL-P2A. In the zymosan-induced abdominal contortion model, both CL-P2 (1 or 10 mg / kg) (16.67 ± 2.17 and 9.16 ± 2.93, respectively) and CL-P2A (1 or 10 mg / kg) kg) (3.57 ± 1.17 and 4.83 ± 0.70, respectively) reduced the number of contortions when compared to the untreated group (33.50 ± 6.18). Investigating the mechanism of action, it was observed that none of the compounds CL-P2 (10 mg / kg) or CL-P2A (10 mg / kg) - reduced the influx of neutrophils into the peritoneal cavity, assessed indirectly by MPO activity (3 , 39 ± 0.83 and 3.68 ± 0.29, respectively), when compared to the untreated group (3.32 ± 0.29); however, the antinociceptive effect of CL-P2 was associated with a reduction in nitrite / nitrate levels (0.607 ± 0.009), while the antinociceptive effect of CL-P2A was associated with an increase in SOD activity (2.222 ± 0.113), when compared to the untreated group (nitrite 0.66 ± 0.01 and SOD 1.683 ± 0.008), respectively). Acute and subacute toxicity tests did not reveal evidence of changes when compared to the untreated group. CL-P2 and CL-P2A, acting by different mechanisms of action, reduce inflammatory pain and appear safe when administered to mice for 14 days, suggesting the efficacy and preclinical safety of CL-P2 and CL-P2A. Still, considering that its theoretical pharmacological targets are associated with the modulation of inflammatory pain, these data can support the bioprospecting of new drugs to control these events.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/58607
metadata.dc.type: Tese
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