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Title in Portuguese: Avaliação dos mecanismos de proliferação e tipos de morte celular na lesão induzida pela Escherichia coli enteroagregativa e sua modulação por alanil-glutamina e betacaroteno
Author: Prata, Mara de Moura Gondim
Advisor(s): Bindá , Alexandre Havt
Keywords: Escherichia coli
beta Caroteno
Apoptose
Issue Date: 2013
Citation: PRATA, M. de M. G. Avaliação dos mecanismos de proliferação e tipos de morte celular na lesão induzida pela Escherichia coli enteroagregativa e sua modulação por alanil-glutamina e betacaroteno. 2013. 122 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2013.
Abstract in Portuguese: A Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) está entre os mais importantes agentes associados às doenças diarreicas persistentes (DP) e mostrou-se prevalente em estudos na população infantil em comunidades carentes da cidade de Fortaleza. A EAEC causa lesão e inflamação intestinal levando a DP e, quando associada à desnutrição, pode ocasionar um déficit cognitivo e redução do crescimento infantil. Este estudo analisou in vitro (IEC-6 e HEp-2), o papel da alanil-glutamina (AG) e do betacaroteno nos mecanismos de proliferação, apoptose e necrose e em resposta a lesão intestinal induzida por uma cepa EAEC selvagem (LDI001), uma cepa controle EAEC 042 e uma cepa de E. coli HS comensal. A cepa LDI001 foi isolada de uma criança desnutrida. Na viabilidade celular houve uma redução significativa (p<0.05) pós-infecção com as EAECs nas concentrações de 105UFC/mL nos tempos de 12, 24 e 48 horas. Contudo, a cepa comensal apenas alterou no tempo tardio (48h). As células lesionadas por EAEC diminuíram a transcrição (p<0.05) do mRNA dos genes c-jun e c-fos e, apenas tardiamente (12h), com a cepa comensal. A apoptose celular aumentou (p<0.05) após a infecção com todas as cepas em 24h. Porém, o dano persistiu elevado apenas nas células tratadas com as cepas de EAEC. A cepa 042 aumentou as células necróticas (p<0.05) em todos os tempos, embora a LDI001 causou o dano apenas em 24h.Todas as células infectadas sofreram aumento da transcrição (p<0.05) de caspase 8 em 12h. Houve aumento trascricional (p<0.05) de NF-kB em 12h nas células infectadas. Enquanto os níveis de transcrição de IL-8 foram altos imediatamente ao termino da infecção (0h) e houve redução em 12h. A LDI001 causou redução da viabilidade celular vinculada à sua ação apoptótica. A EAEC 042 induziu danos tanto pela apoptose como a necrose celular. A cepa comensal mostrou um perfil diferenciado das outras cepas provavelmente por não apresentar genes de virulência. A suplementação com AG 1mM foi capaz de aumentar a proliferação celular (p<0.05) associado a redução da apoptose e necrose (p<0.05) nas células pós-infectadas nos tempos de 12, 24 e 48h. Contudo, a presença de AG 1mM nas células infectadas não alterou os baixos níveis transcricionais de c-jun e c-fos promovidos pela infecção, e não conseguiu bloquear a transcrição significante (p<0.05) de caspase 8. Os níveis de transcrição de NF-kB ainda permaneceu aumentado (p<0.05) na presença de AG em células pós-infectadas no tempo de 12h. Percebeu-se a continua redução temporal da transcrição de IL-8 não estava associada ao tratamento das células infectadas com AG 1mM. A suplementação com AG obteve efeitos positivos na proteção epitelial contra os danos causados pela infecção das cepas tanto nos processos proliferativos quanto na inibição de morte celular. Contudo, a alanil-glutamina não bloqueou a transcrição de caspase 8 podendo sua função antiapoptótica estar relacionada a outra via de ação no presente modelo em estudo. O tratamento com betacaroteno promoveu a reversão do dano na viabilidade celular significativa (p<0.05) apenas em 24h após infecção. Enquanto a presença do betacaroteno em células pós-infectadas com EAEC selvagem causou aumento de apoptose e necrose (p<0.05) em 48h. Células infectadas tratadas com betacaroteno não aumentaram os níveis de c-jun e c-fos e também não conseguiram bloquear a transcrição de caspase 8 e aumentaram (p<0.05) os níveis de caspase 3 no tempo de 12h. O betacaroteno mostrou-se potencialmente lesivo às células causando morte celular, provavelmente, relacionado aos seus efeitos prooxidantes.
Abstract: Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) is among the most important agents associated with persistent diarrhea (DP) and was prevalent in studies in children in poor communities in the city of Fortaleza. EAEC cause intestinal injury and inflammation leading to DP and, when combined with malnutrition, can cause a cognitive deficit and infant growth impairment. The current study examined in vitro (IEC-6 and HEp-2) intestinal pathophysiology of three strains: EAEC wild type, EAEC 042 (positive control) and non-pathogenic E.coli HS as well as the role of alanyl-glutamine (AG) and beta-carotene in the mechanisms of proliferation, apoptosis and necrosis in response to the injury caused by EAEC strains. The wild type strain was isolated from a malnourished child. Intestinal cells viability assay in showed a significant reduction (p<0.05) after post-infection with EAEC strains at concentrations of 105UFC/mL in 12, 24 and 48 hours. However, the E.coli HS only changed the intestinal cell viability after 48 hours. EAEC post-infected intestinal cells presented mRNA transcription decrease (p<0.05) of c-jun and c-fos at the period of zero, 6 and 12 hours after infection was terminated, but E.coli HS showed this decrease only after 12h of infection. Intestinal cell apoptosis increased after infection by all strains 24h of infection. However, the cell damage remained intense in the cells treated only with EAEC strains. EAEC 042 increased cell necrosis (p<0.05) in all evaluated periods, but the wild type strain caused damage with only at the period of 24h. All infected cells had a mRNA transcription increase of caspase 8 gene (p<0.05) in12h. NF-kB mRNA transcription increase (p<0.05) was seen in infected cells only in the period of 12h. While transcription levels of IL-8 were extremely high immediately after the infection was interrupted (0h), that was a drastic reduction at 12h after the end of infection. The wild type strain caused a reduction in cell viability linked apoptosis. However, EAEC 042 induced this decrease as also cellular necrosis. E. coli HS showed a different infection profile probably because its lack of virulence genes. AG 1mM supplementation was able to enhance cell proliferation (p<0.05) associated with apoptosis and necrosis reduction (p<0.05) in post-infected cells at the periods of 12, 24 and 48h. However, the presence of AG 1mM in infected cells did not affect the mRNA transcription low levels of c-jun and c-fos as seen after EAEC infection, and failed to block caspase 8 mRNA transcription increase (p<0.05). The IL-8 mRNA transcription temporal reduction was not associated with AG treatment in post-infected cells. Supplementation with AG had positive effects on epithelial protection against damage caused by both EAEC strains in proliferation assay and inhibition of cell death. However, since caspase 8 mRNA transcription decrease was not observed after AG treatment, AG anti-apoptosis feature could be probably related to another mechanism. Beta-carotene cell damage reversal on cell viability assay was statistical significant (p<0.05) 24 hours after infection was ended. Beta-carotene caused 48h apoptosis and necrosis (p<0.05) in wild type strain post-infected cells. Infected cells treated with beta-carotene could not block c-jun and c-fos mRNA transcription reduction and also failed to inhibit caspase 8 mRNA transcription, but beta-carotene itself increased levels of caspase 3 at the period of 12h after infection. Beta-carotene was shown to be potentially harmful to intestinal cells causing cell death probably related to its pro-oxidant effects.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/7181
metadata.dc.type: Dissertação
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