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Title in Portuguese: Estudo da atividade enzimática e dos efeitos do veneno da serpente Bothropoides insularis sobre macrófagos RAW 264.7 in vitro
Author: Menezes, Ramon Róseo Paula Pessoa Bezerra de
Advisor(s): Martins , Alice Maria Costa
Keywords: Macrófagos
Citotoxinas
Venenos de Serpentes
Issue Date: 2013
Citation: MENEZES, R. R. P. P. B. de. Estudo da atividade enzimática e dos efeitos do veneno da serpente Bothropoides insularis sobre macrófagos RAW 264.7 in vitro. 2013. 95 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2013.
Abstract in Portuguese: Em todo o mundo, são registrados mais de 3 milhões de acidentes envolvendo picadas de animais peçonhentos por ano, das quais 125 a 150 mil culminam em óbito. No Brasil, a maioria dos casos ocorre com serpentes dos gêneros Bothrops e Bothropoides, provocando uma grande variedade de complicações locais e sistêmicas, dentre os quais se destacam efeito mionecrótico, coagulação intravascular disseminada, citotoxicidade, insuficiência renal aguda e sepse. A serpente Bothropoides insularis é uma espécie nativa da Ilha de Queimada Grande, cujo veneno apresenta efeito tóxico acentuado em diversos modelos experimentais. Entretanto, pouco é conhecido a respeito do efeito dessa peçonha sobre células com função de defesa, nem o quanto esse efeito pode influenciar na toxicidade observada in vivo. O presente trabalho teve como objetivo investigar as alterações celulares induzidas pelo veneno total da serpente Bothropoides insularis (BinsVT) sobre macrófagos murinos da linhagem RAW 264.7. Nesse contexto, foi realizada a determinação da atividade proteolítica e da produção de peróxido de hidrogênio in vitro de BinsVT através de reações colorimétricas. Os resultados demonstraram alta atividade catalítica em ambos os testes, sugerindo que os efeitos biológicos desse veneno podem estar relacionados à presença de enzimas como metaloproteinases (svMPs) e L-aminoácido oxidases (LAAOs) em concentrações relevantes nas condições experimentais adotadas. A determinação do potencial citotóxico foi realizada pelo método de redução do MTT, um teste de avaliação da capacidade oxirredutora das células, após 2, 6, 12 e 24 horas de incubação. Foi observado efeito citotóxico em altas concentrações de forma tempo-dependente, com morte celular mais pronunciada nas concentrações de 200 e 100 µg/mL após 12 e 24 horas de tratamento. Nas menores concentrações estudadas, ocorreu um aumento gradativo da viabilidade celular, com valores percentuais em torno de 200% em relação ao grupo controle nos grupos tratados por 24 horas. Esse resultado sugere a presença de efeito proliferativo de BinsVT sobre essa linhagem celular. Em seguida, a atividade da enzima lactato desidrogenase (LDH) no sobrenadante de cultivo dos grupos experimentais foi determinado para investigação de lise celular induzida por BinsVT. Foi verificado aumento significativo da atividade dessa enzima em todos os grupos testados, sugerindo a coexistência de frações com efeito proliferativo e citotóxico, e a concentração e o tempo de exposição do veneno determinam qual irá prevalecer. Para avaliação morfológica das células RAW 264.7 após exposição à substância em estudo, os experimentos foram realizados na superfície de lamínulas, para coloração com May-Grunwald Giemsa. Os grupos experimentais foram analisados por microscopia óptica e as características morfológicas mais representativas foram fotomicrografadas. Foram observadas diversas alterações morfológicas, tais como aparecimento de fragmentos celulares e núcleos desnudos, células vacuolizadas, redução do volume celular e aumento de projeções citoplasmáticas. Por fim, o mecanismo de morte celular induzida por BinsVT foi avaliado por citometria de fluxo, pela marcação com o iodeto de propídio (PI) e a anexina V-FITC. A análise revelou a presença de envolvimento necrótico e apoptótico no efeito citotóxico da substância, além do aparecimento de células marcadas duplamente com PI e anexina-FITC, indicando a ocorrência de apoptose tardia. Em conclusão, BinsVT apresenta efeito citotóxico sobre macrófagos RAW 264.7, com aparente envolvimento de necrose e apoptose, além de provável efeito estimulatório sobre essas células, de forma concentração- e tempo-dependente. Esses efeitos podem estar relacionados às atividades enzimáticas encontradas in vitro.
Abstract: Around the world, there are recorded over 3 million accident involving bites of venomous animals per year, of which 125 to 150 thousand culminate in death. In Brazil, most cases occur with snakes from Bothrops and Bothropoides genus, causing several local and systemic complications, such myotoxicity, disseminated intravascular coagulation, cytotoxicity, acute renal failure and sepsis. Bothropoides insularis is a snake from Queimada Grande Island, whose venom shows pronounced toxicity. However, its effect over cells with defense function remains unclear, as well as how these effects can influence the toxicity observed in vivo. The present study aimed to investigate the cellular changes induced by Bothropoides insularis whole venom (BinsVT) over murine macrophage from RAW 264.7 lineage. In this context, colorimetric tests were performed to determine proteolytic activity and the production of hydrogen peroxide in vitro. The results showed high catalytic activity in both tests, suggesting that the biological effects of this venom may be related to the presence of enzymes such metalloproteinases (svMPs) and L-amino acid oxidases (LAAOs) at concentrations relevant in these experimental conditions. The determination of the cytotoxic potential was conducted by MTT reduction assay, a method of assessing redox metabolism, after 2, 6, 12 and 24 hours of incubation. It was observed cytotoxic effect at high concentrations in a time-dependent way, with cell death more evident at 200 and 100 µg/mL after 12 and 24 hours of treatment. In lower concentrations, there was a gradual increase in cell viability, reaching around 200% of cell viability in groups treated for 24 hours. This result suggests that BinsVT possess proliferative effect over these cells. Then, lactate dehydrogenase (LDH) activity was determined in culture supernatants from experimental groups for investigation of cell lysis induced by BinsVT. It was observed a significant increase in enzymatic activity in all groups, suggesting the coexistence of fractions with cytotoxic and proliferative effect and that concentration and exposure time determine its outcomes. For morphological evaluation of RAW 264.7 cells after exposure to BinsVT, the experiments were performed on the surface of coverslips for staining with May-Grunwald Giemsa method. The experimental groups were analyzed by optical microscopy and the most representative morphological characteristics were photographed. Various morphological changes were observed, such as appearance of cellular debris and bare nuclei, vacuolated cells, reduced cell volume and increased cytoplasmic projections. Finally, the mechanism of cell death induced by BinsVT was assessed by flow cytometry, by staining with propidium iodide (PI) and annexin V-FITC. The analysis revealed the presence of apoptosis and necrosis, and the appearance of doubly labeled cells with Annexin-FITC and PI, indicating the occurrence of late apoptosis. In conclusion, BinsVT has a cytotoxic effect on RAW 264.7 cell, which necrotic and apoptotic mechanisms, besides stimulatory effect on these cells in dose-and time-dependent ways. These effects may be related to the enzymatic activities found in vitro.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/7694
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